高效液相色譜法同時測定抗腦衰膠囊中3種成分含量

賈永亮，韓桂茹，李曉燕

（1．河北省鹽山人民醫(yī)院藥劑科，河北 滄州 061300； 2．河北省食品藥品檢驗院，河北 石家莊 050011；3．河北以嶺醫(yī)藥研究院，河北 石家莊 050035）

目前，中藥復方提取制劑的質(zhì)量控制方法多是單成分的定量測定[1－3]，一個含 3 項含量測定的質(zhì)量檢測[4－5]，至少需 3 d，費時、費力、費資，制約著多組分定量測定質(zhì)量標準的提高。為尋求高效率、低成本、一測多評的快速測定方法，筆者對抗腦衰膠囊（由熟地黃、制何首烏、人參、黃芪、白芍、遠志、茯神、石菖蒲、酸棗仁、卵磷脂、枸杞子、葛根、丹參、黃芩、維生素 E等21味藥物組方）進行了多組分同時定量測定研究。雖有文獻報道抗腦衰膠囊中葛根素和二苯乙烯苷的測定[6]方法，但要求用Nova－Pak C18色譜柱，在320 nm波長下檢測2種成分含量，葛根素因處于吸收峰的尾端，靈敏度低。筆者首次采用等度洗脫、普通C18反相色譜柱同時測定葛根素、芍藥苷、二苯乙烯苷的含量，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（島津 LC－10ADVP泵、SPD－M10AVP二極管陣列檢測器、CLASS－VP LC色譜工作站）。抗腦衰膠囊（石家莊四藥有限公司，批號為 050104，041069，041071），葛根素對照品（批號為110752－200511，供含量測定用），芍藥苷對照品（批號為110736－200526，供含量測定用），二苯乙烯苷對照品（批號為110844－200404，供含量測定用），均購自中國藥品生物制品檢定所。流動相所用試劑為色譜純，其他試劑、試藥均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：乙腈－0．1%磷酸（12 ∶88）；檢測波長：230 nm；柱溫：室溫；流速：1．0 mL ／min。理論板數(shù)按芍藥苷峰計算應不低于2 000。

2．2 溶液制備

分別精密稱取葛根素、芍藥苷和二苯乙烯苷對照品適量，加30%甲醇制成每 1 mL含葛根素 0．01 mg、芍藥苷 0．015 mg、二苯乙烯苷0．013 mg的溶液，作為對照品溶液。取裝量差異項下的本品內(nèi)容物，研細，取約0．11 g，精密稱定，置容量瓶中，加 60%的甲醇20 mL，超聲處理10 min，用60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液。取缺少葛根或白芍或何首烏的樣品，按供試品溶液方法制備陰性對照品溶液。

2．3 測定波長選擇

采用日本島津公司生產(chǎn)的二極管陣列高效液相色譜儀，對樣品和對照品的高效液相色譜峰分別進行光譜掃描。結(jié)果表明，葛根素在紫外區(qū)有3個吸收峰，且對照品和供試品波峰一致，分別在200，250和305 nm波長處；芍藥苷有2個吸收峰，且對照品和供試品波峰一致，分別在200和230 nm波長處；二苯乙烯苷有2個吸收峰，且對照品和供試品波峰一致，分別在213和320 nm波長處。從3種成分的光譜圖可見，其共有的最佳吸收在230 nm波長處，該處正是芍藥苷的最大吸收波長；對于葛根素和二苯乙烯苷，該處正是二者的吸收交叉點，雖不是其最大吸收波長，但也均處于較高的吸收處，故擬以230 nm為三者的共有測定波長，見圖1。

2．4 方法學考察

陰性干擾試驗：分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀測定。結(jié)果對照品溶液與供試品溶液色譜峰保留時間一致，陰性無干擾，見圖2。

圖1 3種成分光譜掃描圖

線性關系考察：分別精密稱取葛根素、芍藥苷和二苯乙烯苷對照品適量，加 30%的甲醇制成每 1 mL含葛根素 2．17，5．43，1．357，33．92，50．88 μg， 含 芍 藥 苷 3．74，9．34，23．36，58．40，146 μg，含二苯乙烯苷 2．82，7．04，17．6，44，110 μg 的溶液。各進樣20 μL，測定其峰面積。以峰面積積分值（Y）為縱坐標、進樣量（X）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程 Y葛＝3 673 540 X＋9 137（r＝ 0．999 8），Y芍＝1 494 009．4 X ＋ 2 859（r＝0．999 9），Y二＝2 473 263．6 X ＋46 441(r＝0．999 7)。結(jié)果表明，進樣量葛根素在 0．043 4 ～ 1．018 μg、芍藥苷在 0．074 8 ～ 2．92 μg、二苯乙烯苷在0．056 4～2．2 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關系。

圖2 高效液相色譜圖

精密度試驗：取同一對照品溶液，各進樣5次，測定峰面積。結(jié)果峰面積平均值葛根素為 932 898(RSD為 0．88%)，芍藥苷 為 645 014(RSD為 0．67%)，二苯乙烯苷為 874 332(RSD為 1．22%)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，每隔3 h進樣1次，考察18 h內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果峰面積平均值葛根素為831 047(RSD為1．02%)，芍藥苷為 553 830(RSD 為 1．57%)，二苯乙烯苷為550 308(RSD為 1．16%)，表明供試品溶液中葛根素、芍藥苷、二苯乙烯苷在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：按高、中、低3個劑量，取同一批（批號為041069）樣品6份，按2．2項下方法及擬訂色譜條件進行提取，制備，測定。結(jié)果平均含量葛根素為 2．08 mg／g(RSD 為 1．16%)；芍藥苷 為 1．95 mg ／g(RSD 為 1．36%)， 二 苯 乙 烯 苷 為 3．17 mg ／g(RSD為2．32%)，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的同一批（批號為041069）樣品6份，每份0．055 g，按高、中、低 3個劑量分別加入一定量的對照品，按擬訂方法處理進行提取、制備、測定，計算回收率。結(jié)果見表 1。

表1 葛根素、芍藥苷、二苯乙烯苷加樣回收試驗結(jié)果(n＝6)

色譜柱耐用性試驗：取同一（批號為041069）供試品溶液，選用不同廠家、不同型號的色譜柱進行測定。結(jié)果3種色譜柱的測定結(jié)果基本一致，表明3種成分分離良好，見表2。

表2 不同色譜柱測定的同一樣品含量(mg／g)

2．5 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液并測定含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品中葛根素、芍藥苷和二苯乙烯苷的含量測定結(jié)果(n＝3)

3 討論

已有其他樣品中葛根素與芍藥苷含量測定的研究，但因組方不同，測定方法各異，有單獨測定[7－8]，也有采用同一流動相在240 nm或230 nm波長下同時測定[9－10]，前者比后者多花費1倍的時間與試劑。其他樣品中葛根素與二苯乙烯苷含量測定的研究多采用梯度洗脫，在各自最大波長下同時測定[11－12]，要求儀器必須配備梯度洗脫與二極管陣列檢測器，儀器的性能、成本提高，應用受限，難以普及。雖然有同時測定芍藥苷與二苯乙烯苷的報道[13]，但是與其他成分一同測定的，在230 nm檢測波長下要經(jīng)7次梯度變換，波峰基線平穩(wěn)度不好。目前尚未見同時測定葛根素、芍藥苷與二苯乙烯苷3種成分的報道。

本研究采用島津高效液相SPD－M10AVP二極管陣列檢測器，同時考察了葛根素和二苯乙烯苷在各自最大波長250，320 nm和共有測定波長230 nm下的線性相關系數(shù)，結(jié)果顯示，二者在各自最大波長和共有測定波長下基本一致，而且同一供試品在各自最大波長和共有測定波長下測定的含量無差異。因此，采用230 nm為檢測波長，只需一臺帶紫外檢測器的普通色譜儀，即可準確進行3種中藥所含3類性質(zhì)各異的成分的定量測定，成本低，效率高，值得推廣。

參考文獻：

[1]樊 燕，饒光玲．歸芍膠囊中白芍的鑒別和芍藥苷含量測定[J]．貴陽醫(yī)學院學報，2012，37（3）：259 －262．

[2]王金宏，李 馨．感冒清熱口服液中葛根素含量測定[J]．黑龍江醫(yī)藥，2010，23（1）：1 － 2．

[3]王 麗，李忠貴，饒印保．益視顆粒中二苯乙烯苷的含量測定研究[J]．江西中醫(yī)藥，2010，41（6）：71 － 72．

[4]何選林，王群英．RP－HPLC腦絡通膠囊中原兒茶醛、阿魏酸、丹參酮ⅡA和鹽酸托哌酮的含量[J]．中成藥，2011，33（1）：61 －65．

[5]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（一部）[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:612．

[6]郭炎榮，路 玫．反相高效液相色譜法同時測定抗腦衰膠囊中葛根素和2，3，5，4－四羥基二苯乙烯 －2－O－ －D－葡萄糖苷的含量[J]．時珍國醫(yī)國藥，2008，19（1）：110 － 111．

[7]王 宛，王建明．HPLC法測定頸通茶中葛根素和芍藥苷的含量[J]．中國中醫(yī)藥科技，2010，17（6）：529 － 530．

[8]譚家華，羅 君，賀祝英，等．HPLC法測定眼保Ⅰ號膠囊中葛根素和芍藥苷的含量[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學，2012，40（12）：7 067 －7 071．

[9]莊惠清，柯鵬頡．HPLC法測定心腦康膠囊中葛根素和芍藥苷的含量[J]．福建醫(yī)藥雜志，2012，34（3）：73 － 75．

[10]胡 翮．HPLC法同時測定益腦復健膠囊中葛根素和芍藥苷的含量[J]．中國藥師，2012，15（4）：580 －582．

[11]袁 霞，劉唯芬，張艷君．RP－HPLC法測定葛根解酒片中葛根素和二苯乙烯葡萄糖苷的含量[J]．沈陽藥科大學學報，2012，29（3）：216－218．

[12]李國萍，劉唯芬，于開軍．RP－HPLC法測定脂降寧片中葛根素、二苯乙烯苷的含量[J]．中華中醫(yī)藥學刊，2011，29（9）：2 131 －2 133．

[13]馮 兵，陳 婷，趙瑞之，等．HPLC測定復方昆丹膠囊中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、二苯乙烯苷、五沒食子酰葡萄糖[J]．中國實驗方劑學，2012，18（7）：112 － 116．