cDNA睞FLP技術及其在基因差異表達中的應用

王超 曲曉軍 崔艷華

摘要cDNAAFLP技術是一種在轉錄水平上研究基因差異表達的分子生物學實驗技術，由于其具有起始材料量少、假陽性低、重現性、靈敏度高且不需預先知曉序列信息等優點，被廣泛應用于各類生物差異表達基因的研究。

關鍵詞cDNAAFLP；基因差異表達；技術特點；應用

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）21-06937-04

cDNAAFLP Technology and Its Application in Gene Differential Expression

WANG Chao， CUI Yanhua et al （School of Food Science and Engineering， Harbin Institute of Technology， Harbin， Heilongjiang 150090）

Abstract cDNAAFLP is a kind of molecular biological experimental technology which detects differential expression of genes at the transcriptional level. Due to its little material， low false positive， high repeatability， high sensitivity and less sequence information is widely used in various types of studies of biological gene differential expression. The basic principle， development history， technical characteristics and the potential application of cDNAAFLP technology in lactic acid bacteria fermentation was discussed.

Key words cDNAAFLP； Differential gene expression； Technical characteristics； Application

基金項目國家自然科學基金資助項目（30901048）。

作者簡介王超（1989- ），女，黑龍江佳木斯人，碩士生研究生，研究方向：分子微生物學。*通訊作者，副教授，博士，博士生導師，從事分子微生物學方面的研究。

收稿日期20140623基因的差異表達是調控細胞生命活動的核心機制[1]。目前，在轉錄水平上，對差異表達基因進行篩選分析的方法主要包括Northern雜交、基因芯片技術（DNA chip technique）、消減雜交（subtractive hybridization）、差示篩選（differential screening）、mRNA差異顯示PCR（Differential Display Reverse Transcription PCR，DDRTPCR）、DNA微陣列（microarray）分析、基因表達系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）及cDNAAFLP（cDNA amplified fragment length polymorphism，cDNAAFLP）等。其中基因芯片技術、SAGE和cDNAAFLP可對生物體轉錄組進行大規模全面系統分析?；蛐酒钱斍按_定基因差異表達的常用技術之一，但利用該技術的前提條件是熟悉所研究對象的遺傳背景，同時該技術對于低豐度的基因往往難以檢測。另外該技術需要昂貴的設備和高昂的試驗成本，一般實驗室難以完成。

cDNAAFLP技術可以對未知基因組序列的生物進行基因差異表達研究。該技術最早廣泛用于植物基因差異表達研究，與基因芯片技術相比，cDNAAFLP技術操作簡單、不需要特殊儀器設備、成本相對低廉，且該技術的靈敏性和特異性可與基因芯片技術相比擬[2]。近年該技術不斷改進和完善，已成功用于巴西固氮螺菌、鼠李糖乳桿菌等多種微生物的基因研究[3-4]。cDNAAFLP技術在基因差異表達研究中日益顯示其顯著地優勢，筆者就cDNAAFLP技術的基本原理、發展歷史、技術特點以及該技術在植物、微生物等領域的應用進行闡述，并對該技術在微生物研究中的應用前景進行了展望。

1cDNAAFLP技術的發展歷史與基本原理

cDNAAFLP技術是由AFLP（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技術發展而來。AFLP技術由荷蘭Keygene公司的Zabeau和Vos等于1992年創建[5]，是RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）技術和PCR技術相結合的產物。RFLP基本原理是由于DNA突變增加或減少了某些內切酶位點，在限制性內切酶作用下，產生大小不等的片段，從而反映出不同樣品DNA水平上的多態性。cDNAAFLP技術將RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）和AFLP [5]技術相結合，研究基因的差異表達。

cDNAAFLP的試驗流程大致可分為4步：①模板的制備和cDNA的合成。以純化的mRNA為模板，反轉錄合成雙鏈cDNA；②雙鏈cDNA片段雙酶切和人工接頭的連接。用識別序列分別為6和4 bp的2種限制性內切酶，酶切雙鏈cDNA。獲得的酶切片段與人工接頭連接；限制性內切酶的選擇主要取決于酶切位點出現的頻率；③酶切片段的預擴增和選擇性擴增。利用與接頭序列互補的引物進行預擴增和選擇性擴增；④聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。擴增產物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示，從而確定差異基因 [6-8] （圖1）。

1996年BACHEM等[6]首次應用cDNAAFLP技術研究了土豆塊莖形成過程中的基因表達過程。研究者研究了儲存蛋白Patatin和編碼ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因轉錄水平的表達變化。分析結果與Northern分析的結論一致，證實了cDNAAFLP研究發育調控基因的可行性。同年，MONEY等[9]首次在小麥上應用了該技術，說明cDNAAFLP技術具有廣泛的應用范圍。1998年BACHEM等[10]深入研究了cDNAAFLP技術的影響因素，分析了PCR循環數目及模板稀釋水平對反應的影響，檢測了擴增中Mg2+濃度的影響作用。此方法最早應用于植物中[3]，目前國內外已應用于羅薩花、水稻、番茄、紅花、棉花[11-15]等植物抗旱性、耐鹽性、抗病蟲性、發育不同時期基因表達等的研究。隨著該技術的完善和發展，近年來該技術也應用于動物、微生物等方面研究，如用于昆蟲基因表達差異性研究等[16]。HENRIQUEZ等[17]使用消減雜交和cDNAAFLP結合的方法鑒定和克隆參與馬鈴薯和馬鈴薯晚疫病菌之間相互作用而差異表達的基因，在分析細菌的基因表達圖譜方面取得了一定成果。

圖1cDNAAFLP試驗流程42卷21期王 超等cDNAAFLP技術及其在基因差異表達中的應用2cDNA –AFLP技術特點

2.1重復性好，假陽性低，可檢測低豐度表達的mRNAcDNAAFLP對PCR模板和條件的要求不高，一般用2個選擇性堿基即可得到較穩定的差異片段。如果增加1個選擇性堿基，可進一步減少擴增出片段的假陽性。因試驗中經過2次PCR擴增，表達量較低的mRNA也易被檢測出來，大大提高了反應的靈敏性[18]。當高通量測序不可用時，用改進的、成本效益好的cDNAAFLP探討轉錄獲得的產品。雖然高通量測序成本正在減少，往往對于個體項目目標成本仍較高，如在非模式生物全基因組轉錄的研究中。要排除重復的PCR，克隆和廣泛存在重疊的轉錄，這些都會降低方法的效率[19]。

2.2反映基因之間表達量的區別cDNAAFLP技術由于其反應條件的嚴謹性，擴增產物的水平依賴于單個模板的濃度，故可對基因組的表達量呈現一個可靠的結果[6]。LI等[3]采用cDNAAFLP技術檢測與固氮螺菌細胞趨化和包囊有關基因表達的差異，結果顯示3個不同的TDFs（AB46，AB58和AB63）與聚羥基丁酸酯解聚酶的C 末端、細胞形狀決定蛋白質及鞭毛域蛋白存在同源性。11個TDFs顯示與信號轉導蛋白存在同源性，這些信號轉導蛋白包括與氮調節蛋白NtrY同源的蛋白及硝酸鹽/亞硝酸鹽反應調節蛋白，這些基因表達量之間的差異被準確反映出來。

2.3全面獲取轉錄組的表達信息據推測，植物基因組中可編碼16 000～33 000個基因。若選擇合適的酶切組合進行分析，幾乎所有的表達基因包括表達量極低的基因均可用cDNAAFLP技術檢測到。一般cDNAAFLP擴增片段的大小在100～1 000 bp，平均每對引物能擴增出約50條譜帶。因此，利用一對合適的內切酶組合和256對引物即可得到約13 000條帶，所提供的信息量大，對于生物某個特定組織或者發育階段而言，能夠較全面地獲取轉錄組的信息。SILVA 等[20]采用cDNAAFLP分析揭示了植物黃單胞菌全基因組。

2.4分析樣品所需量少預擴增過程為選擇性擴增提供了大量充足的模板，這也是cDNAAFLP只需要很少起始材料即可進行的原因。且cDNAAFLP所用的原始材料量極少，每份樣品100～200 mg，便可進行cDNAAFLP的飽和篩選，即便是較難獲得樣品的組織如花粉粒、線粒體、葉綠體等也能適用。用AFLP分析DNA時，需要有3個選擇性堿基[5]，而cDNA相對簡單，利用2個選擇性堿基即可。這大大擴大了cDNAAFLP技術的適用范圍，這也是該技術得以廣泛應用的重要原因之一。

3cDNAAFLP技術的應用

3.1基因的表達與調控研究研究者通過cDNAAFLP技術研究基因不同時空的表達情況，降低了經典mRNA差異顯示技術的假陽性，同時對低水平表達基因更敏感，并使操作更安全。

LEYMARIE等[21]研究大麥種子休眠和非休眠胚胎的差異表達從而闡明休眠的分子調控機制。研究發現，39個TDFs差異表達，其中25個被克隆和測序。8個在后熟過程中差異表達，其中7個下降，可能是由于后熟降解。確定其中一個轉錄表達片段hv13b與果糖6磷酸2激酶/果糖2，6二磷酸酶具有同源性，可能對于維持休眠大麥或者其他可能谷物有作用。BOTTON等[22]研究炭黑曲霉生產的赭曲霉毒素，對2株炭黑曲霉進行了cDNAAFLP差異顯示篩選，結果表明，抑制菌種生產能力的基因包含 119個差異表達序列，這些差異序列不同程度地參與赭曲霉毒素生物合成的調節。LIN等[23]研究發現對于苜蓿中華根瘤菌堿性應力和鉀運輸調控所必須的ABC載體，揭示了7個基因簇中前4個基因編碼假定的糖轉運三磷酸腺苷結合盒（ABC）載體的特征組分。存在鉀時，根瘤菌中調控鉀吸收的3個基因的轉錄，trkH，kdpA和kupI，在supA突變體中表達明顯減弱。BOVE等[4]研究奶酪中的鼠李糖乳桿菌的轉錄反應。利用3對引物檢測該菌在MRS培養基中64個基因的表達及該菌在奶酪培養基中96個基因的表達。cDNAAFLP方法能夠證明鼠李糖乳桿菌很大一部分基因表達的變化。這是第一次通過cDNAAFLP技術從奶酪和少數有關細菌轉錄分離得到的鼠李糖乳桿菌。

3.2分離特異表達基因分析基因表達的差異，尋找分子標記的最終目的是為了分離基因以及研究該基因對于生物體個體發育的影響。

DELLAGEI等[24]采用cDNAAFLP分析原核植物軟腐病病原菌差異表達的基因，結果表明，在蛋白質水平，這些基因與油菜黃單胞菌無毒基因有很大的相似性。Northern分析確認擴增片段的差異片段均來自差異表達的基因。CAMPALANS等[25]鑒定脫水杏仁差異表達的基因，分析了對脫水杏仁強烈響應的幾個基因。預測的多肽與蛋白質序列表現出相似性，包括含氮化合物的轉運、1酰基sn甘油3磷酸?；D移酶、低分子量熱休克蛋白、半胱氨酸蛋白酶和組成富含脯氨酸蛋白的表達。VALVERDE等[26]揭示了固氮螺菌2種菌株在細胞聚集過程中差異表達的相關基因，在高碳氮比誘導下，菌種在指數生長期有81個TDFs差異表達。將差異片段進行測序和分析，通過RTPCR比較野生型Sp7和 Sp72002菌株（含有一個能誘發flca-突變的TN5，不聚集，不區分運動，囊腫樣，在其細胞表面缺乏一些多糖），獲得了編碼10種已知蛋白質基因的表達情況。

3.3毒性、耐受性研究cDNAAFLP技術可以應用于植物抗性品系和敏感品系在轉錄組學上的比較，篩選抗病蟲害的基因，研究結果可以幫助闡明抗性品系的分子機制，以應用于抗病育種研究中。SZCZESNY等[27]采用該技術研究了植物病原細菌——黃單胞菌分泌系統Xcs和Xps的功能特性。轉錄分析表明，Xcv（植物病原菌中的xpst2s系統所分泌，促進疾病發生并有助于效應蛋白的易位，通過Ⅲ型分泌系統（T3S）輸送到植物細胞）的基因表達譜是由T3S系統的主要調控因子hrpg和hrpx激活。xynC（是與毒力相關的木聚糖酶，Xps系統的基質）、細胞外蛋白酶和木聚糖酶活動的表達受到hrpg和hrpx的抑制，這表明Xps系統的組件和基質的調節存在差異。

目前，許多植物對于重金屬的耐受性都是通過cDNAAFLP技術進行研究的。如CHAO等[28]、CICATELLI等[29]分析鋅、銅誘導下植物基因的表達。另外，cDNAAFLP技術對于植物致病菌相關基因的研究也取得了一定進展。ELBEBANY等[30]研究誘導馬鈴薯根提取物中黃萎病致病的相關基因。

3.4構建轉錄連鎖圖LI等[31]構建了太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）的遺傳連鎖圖譜，為定位重要的經濟性狀基因及最終實現太平洋牡蠣的標記輔助選育和遺傳改良奠定了基礎。目前，許多水產生物的基因連鎖圖譜都是采用該技術加以構建的。如日本對蝦（Marsupenaeu japonicus）[32]、皺紋盤鮑（Haliotisdiscus hannai）[33]和條斑紫菜[34]等。QIN等[35]發明了一種計算機程序GenEST，實現了EST序列與cDNAAFLP基因表達信息的雙向連接和轉化。

4小結與展望

cDNAAFLP技術在研究植物差異表達基因方面已經得到了廣泛的應用，隨著近年來該技術的發展，其應用范圍已經逐漸擴展至微生物中差異表達基因的研究。微生物具有結構簡單、繁殖速度快、變異易識別、研究周期短、進展迅速的特點，因此，微生物是研究生物進化的良好材料。通過cDNAAFLP技術對其基因組的研究分析，將為揭示一系列諸如生命起源、生物發育和進化等生命活動的重大基本問題提供極大的幫助。乳酸菌廣泛存在于自然界，與人類關系密切，其中部分乳酸菌為益生菌。當前乳酸菌研究主要集中在發酵、生理特性等方面。近年來大量有益乳酸菌基因組序列的完成，為從分子水平上研究乳酸菌提供了大量的信息，為cDNAAFLP技術在乳酸菌的應用提供了平臺。cDNAAFLP技術能夠在轉錄水平全面系統地獲取乳酸菌的轉錄組學信息，有利于在分子水平上獲悉乳酸菌的代謝機制，尤其是發酵過程中的整體變化，進而促進乳酸菌的應用。

綜上所述，cDNAAFLP技術自誕生之后，在很多研究領域中得到了廣泛應用。cDNAAFLP技術已逐漸成為研究基因差異表達行之有效的方法，是研究功能基因組的新方法、新手段，具有廣闊的應用前景。隨著新技術的出現，以及技術間相互結合使用、優化，該技術必將具有更旺盛的生命力，相信該技術在基因差異表達研究中具有巨大的潛在應用價值。

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