西瓜未授粉子房的離體培養(yǎng)

李玲　閔子揚(yáng)　童龍　李涵　成娟　孫小武

摘 要：為了探討西瓜未授粉子房誘導(dǎo)率的影響因素，以‘早春紅玉、‘西農(nóng)9號(hào)和‘小綠皇為供試材料進(jìn)行西瓜未授粉子房的離體培養(yǎng)，研究供體植株的黑暗熱激處理、基因型、不同取樣時(shí)間、2，4-D濃度和不同激素濃度組合等因素對(duì)其芽點(diǎn)誘導(dǎo)率的影響。結(jié)果表明：西瓜未授粉子房離體培養(yǎng)以33 ℃ 的條件下黑暗熱激4 d效果最佳；以開(kāi)花前1 d的子房誘導(dǎo)率最高為17.2%；3個(gè)品種中僅‘早春紅玉獲得了再生植株，且在激素組合為4.0 mg·L-1 2，4-D + 2.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA時(shí)芽點(diǎn)率最高為15.0%；根據(jù)再生植株的根尖染色體數(shù)目，初步鑒定再生植株中有單倍體植株，還有二倍體和四倍體植株。

關(guān)鍵詞： 西瓜； 未受粉子房； 誘導(dǎo)率； 離體培養(yǎng)； 單倍體； 影響因素

長(zhǎng)期以來(lái)，西瓜常規(guī)育種周期長(zhǎng)、工作量大、遺傳性狀不穩(wěn)定等因素在很大程度上限制了西瓜的育種進(jìn)程。在離體條件下，采用未授粉子房培養(yǎng)來(lái)獲得單倍體植株，是在較短時(shí)間內(nèi)獲得綜合性狀優(yōu)良、高度純合二倍體的快速而有效的方法。目前，在葫蘆科的一些作物上已經(jīng)通過(guò)未授粉胚珠或子房的離體誘導(dǎo)培養(yǎng)途徑成功獲得了單倍體的植株。杜勝利[1]在黃瓜未受精子房的離體培養(yǎng)研究上得到了單倍體植株，并己將研究應(yīng)用到黃瓜的新品種選育上。2009年，葛志東[2]在西葫蘆未受精的子房培養(yǎng)中也得到了單倍體的植株。但是在西瓜上這方面的報(bào)道甚少。只有楊穎[3]通過(guò)未授粉的胚珠離體培養(yǎng)途徑成功獲得了3個(gè)具有再生能力的胚狀體，得出胚狀體R2為單倍體。因此，本試驗(yàn)探究了基因型、取樣時(shí)間、黑暗熱激以及激素濃度等因素對(duì)西瓜未授粉子房離體誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響，以期找到最佳的誘導(dǎo)條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

未授粉子房離體培養(yǎng)以‘早春紅玉、‘西農(nóng)9號(hào)和‘小綠皇3個(gè)西瓜品種為材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的準(zhǔn)備及接種 自第2朵雌花開(kāi)放開(kāi)始，每天上午8：00左右取樣。在無(wú)菌條件下用75%的酒精浸泡30 s，0.3%的次氯酸鈉浸泡滅菌10 min，無(wú)菌水沖洗3次。然后將子房?jī)啥烁髑谐s1 cm、刮去子房的表皮，將去皮后的子房橫切成2 mm左右的薄片，平放在培養(yǎng)基中。每瓶接種子房片6～10塊，每個(gè)處理接種3瓶，3次重復(fù)。

1.2.2 取樣時(shí)間 分別取開(kāi)花前2 d、開(kāi)花前1 d和開(kāi)花當(dāng)天的子房作為試驗(yàn)材料，比較不同取樣時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)率的影響。培養(yǎng)基為MS+3.0 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA。

1.2.3 黑暗熱激 以上述3種西瓜基因型品種的開(kāi)花前1 d的子房作為材料，接種后的子房塊置于33 ℃暗培養(yǎng)，熱激時(shí)間設(shè)為3、4、5、6、7 d 5個(gè)水平。以25 ℃黑暗處理4 d 為對(duì)照。置光照條件下培養(yǎng)1周后，統(tǒng)計(jì)接種子房出胚數(shù)量。

1.2.4 西瓜未授粉子房的胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 先用1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA對(duì)2，4-D濃度進(jìn)行篩選，2，4-D濃度設(shè)為2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mg·L-16個(gè)處理水平。將選出的誘導(dǎo)率較高的2，4-D濃度與不同濃度的6-BA和NAA濃度進(jìn)行組合試驗(yàn)比較，從而選出最佳激素濃度組合。NAA濃度為0.1、0.5 mg·L-1；6-BA濃度為0.5、1.0、2.0 mg·L-1。

1.2.5 西瓜未授粉子房的分化培養(yǎng)基 子房在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周左右，產(chǎn)生明顯的愈傷組織，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基上繼續(xù)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。分化培養(yǎng)基為：6-BA濃度設(shè)為0.2、0.5、1.0 mg·L-1 3個(gè)水平；NAA濃度設(shè)為0.1、0.2、0.5 mg·L-1 3個(gè)水平。每瓶接種有效愈傷2～3塊，每個(gè)處理接種3瓶，3次重復(fù)。

1.2.6 倍性鑒定 采用染色體計(jì)數(shù)法確定再生植株的倍性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

雌核啟動(dòng)率/%=（出胚的子房片數(shù)量/總接種子房片數(shù)量）×100

芽點(diǎn)誘導(dǎo)率/%=（分化出芽點(diǎn)的愈傷數(shù)量/總接種子房片數(shù)量）×100

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 和SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型品種對(duì)西瓜未授粉子房誘導(dǎo)率的影響

基因型對(duì)西瓜未授粉子房的離體誘導(dǎo)培養(yǎng)有很大的影響，本試驗(yàn)所選的3個(gè)西瓜品種在相同培養(yǎng)條件下雌核啟動(dòng)率芽點(diǎn)誘導(dǎo)率差異很大，以‘早春紅玉的芽點(diǎn)誘導(dǎo)率最高為22.2%，其次是‘西農(nóng)9號(hào)的芽點(diǎn)率為10.8%，而‘小綠皇沒(méi)有誘導(dǎo)出胚狀體。但是最后僅‘早春紅玉分化出了再生植株。因此，在相同的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下，基因型不同，各品種的誘導(dǎo)效果也不同，這可能與品種的生理特性和抗逆性有關(guān)。

2.2 不同取樣時(shí)間對(duì)西瓜未授粉子房誘導(dǎo)率的影響

西瓜未授粉子房的雌核啟動(dòng)率對(duì)取樣時(shí)間適應(yīng)范圍比較廣，雖然在不同取樣時(shí)間上雌核啟動(dòng)率表現(xiàn)出不一致，但是各處理間的雌核啟動(dòng)率差異不大。從表1可知，‘早春紅玉、‘ 西農(nóng)9號(hào)和‘小綠皇的芽點(diǎn)率隨取樣時(shí)間的變化而變化，均以開(kāi)花前1 d的子房芽點(diǎn)誘導(dǎo)率最高，分別為17.2%、16.1%和3.3%。這可能是開(kāi)花前1 d的子房胚囊發(fā)育已接近成熟，對(duì)人工誘導(dǎo)較敏感。

2.3 黑暗熱激對(duì)西瓜未授粉子房誘導(dǎo)率的影響

黑暗熱激處理有利于啟動(dòng)雌核發(fā)育，子房片經(jīng)過(guò)熱激處理，胚珠開(kāi)始從子房片中突起，在光照條件下培養(yǎng)1周左右轉(zhuǎn)綠。而沒(méi)有進(jìn)行熱激處理的出胚少，且轉(zhuǎn)綠率低，最終沒(méi)有芽點(diǎn)形成。由表2可知，‘早春紅玉雌核啟動(dòng)率對(duì)熱激處理不敏感，但是其芽點(diǎn)率受熱激處理刺激較大，以處理4 d時(shí)芽點(diǎn)率最高為 14.8%。‘西農(nóng)9號(hào)和‘小綠皇的雌核啟動(dòng)率在各處理間差異較大，分別以處理3 d和處理5 d的雌核啟動(dòng)率最高，但都與處理4 d無(wú)顯著差異。二者的芽點(diǎn)率受熱激處理影響不大，‘西農(nóng)9號(hào)以處理3 d的芽點(diǎn)率最高為12.9%，其次是處理4 d的，‘小綠皇以處理4 d的芽點(diǎn)率最高為4.2%。綜上所述，西瓜未授粉子房的培養(yǎng)以黑暗熱激進(jìn)行處理4 d的誘導(dǎo)效果最佳。

2.4 2，4-D濃度對(duì)西瓜未授粉子房誘導(dǎo)率的影響

2，4-D有利于胚性愈傷組織的形成，在一定范圍內(nèi)對(duì)2，4-D濃度進(jìn)行篩選有利于提高未授粉子房的誘導(dǎo)率。本試驗(yàn)對(duì)6個(gè)2，4-D濃度進(jìn)行了篩選，結(jié)果如表3。‘早春紅玉以2，4-D濃度為3.0 mg·L-1時(shí)芽點(diǎn)率最高為20.0%，其次是3.5、4.0 mg·L-1。‘西農(nóng)9號(hào)芽點(diǎn)率在3.0 mg·L-1時(shí)最高為22.2%，其次是5.0、4.0 mg·L-1。‘小綠皇對(duì)2，4-D濃度不敏感，在各處理間芽點(diǎn)率無(wú)顯著差異，以2，4-D濃度為3.0 mg·L-1時(shí)芽點(diǎn)率最高為4.3%，其次是4.5、5.0 mg·L-1。在沒(méi)有添加2，4-D的培養(yǎng)基上也能形成少部分愈傷，但有效愈傷獲得率低。

2.5 激素組合對(duì)西瓜未授粉子房誘導(dǎo)率的影響

不同激素的組合有利于獲得有效愈傷。因此，本試驗(yàn)采用‘早春紅玉、‘西農(nóng)9號(hào)和‘小綠皇3個(gè)西瓜品種對(duì)不同濃度的2，4-D、6-BA和NAA的組合進(jìn)行了篩選，結(jié)果分別如表4、5和表6。‘早春紅玉對(duì)激素的適應(yīng)范圍較廣，以處理組合A的芽點(diǎn)率最高為15.0%。在只考慮2，4-D的濃度時(shí)，‘早春紅玉以添加濃度為3.0 mg·L-1的2，4-D時(shí)誘導(dǎo)率最佳，但在激素組合中以添加4.0 mg·L-1 2，4-D的誘導(dǎo)率最高。可能是其他2種激素濃度限制了2，4-D的作用，所以篩選出的單個(gè)激素的最適濃度組合在一起不一定能得到最優(yōu)組合。‘西農(nóng)9號(hào)以處理組合a芽點(diǎn)率最高為15.0%。‘小綠皇只在培養(yǎng)基1上誘導(dǎo)出了芽點(diǎn)，芽點(diǎn)率為4.2%，在其他培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率均為0。

2.6 分化培養(yǎng)基對(duì)西瓜未授粉子房誘導(dǎo)率的影響

將培養(yǎng)3周的子房轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化，‘西農(nóng)9號(hào)和‘小綠皇的芽點(diǎn)在培養(yǎng)后期均變褐化或者木栓化，沒(méi)有分化潛力。只有‘早春紅玉愈傷組織迅速膨大，最后在愈傷組織上長(zhǎng)出芽點(diǎn)（圖版1），培養(yǎng)一段時(shí)間后， 在培養(yǎng)基0.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA，0.5 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA和1.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1NAA上分別獲得了3個(gè)、1個(gè)、1個(gè)叢生芽（圖版-2）。但培養(yǎng)基1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1 NAA上分化的叢生芽生長(zhǎng)畸形，可能是激素濃度不適宜的原因。

2.7 再生植株的倍性鑒定

本試驗(yàn)獲得再生植株生根緩慢，只得到極少數(shù)根系。只對(duì)叢生芽進(jìn)行了染色體鑒定發(fā)現(xiàn)有9～10條、20～22條和36～40條染色體（圖版-3），還沒(méi)有完成對(duì)完整植株進(jìn)行鑒定。因有籽西瓜是二倍體作物，且體細(xì)胞染色體數(shù)是22條，所以本試驗(yàn)將所獲得的再生植株的倍性應(yīng)該為單倍體、二倍體和四倍體。

2.8 再生植株的分化情況

再生植株的分化有以下5種情況（圖版-4）：（A）芽分化正常，但是無(wú)論怎么誘導(dǎo)都不能長(zhǎng)出根系，形成只有莖和葉片的植株；（B）芽分化緩慢甚至畸形，形成的植株矮小，根系發(fā)達(dá)，最終也不能伸長(zhǎng)；（C）只長(zhǎng)出2片葉子，但是沒(méi)有分化出生長(zhǎng)點(diǎn)；（D）愈傷組織的一端形成芽，另一端形成根。（E、F）先分化出莖葉，培養(yǎng)一段時(shí)間后長(zhǎng)出根系，形成完整植株。這可能受生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素的比例影響，比例過(guò)高，先生根，再長(zhǎng)芽，然后形成完整植株。比例過(guò)低，先分化出芽，再發(fā)展成完整的植株。因此，還需要對(duì)激素配比進(jìn)行研究，找出最佳的激素濃度。

3 討 論

3.1 黑暗熱激處理對(duì)西瓜未授粉子房雌核啟動(dòng)的影響

黑暗熱激有利于未授粉子房的雌核啟動(dòng)，許多研究均表明35 ℃或者30 ℃熱激效果最好[4-5]。本試驗(yàn)沒(méi)有對(duì)熱激溫度進(jìn)行篩選，直接選用33 ℃進(jìn)行黑暗熱激處理，經(jīng)處理的子房由白轉(zhuǎn)為黃綠色，并且胚珠已開(kāi)始突起，未經(jīng)熱激處理的子房均不能分化出芽點(diǎn)和胚狀體，以熱激處理4 d的子房雌核啟動(dòng)率和芽點(diǎn)率最高。

3.2 基因型對(duì)西瓜未授粉子房離體培養(yǎng)誘導(dǎo)率的影響

在相同條件下，不同基因型品種的誘導(dǎo)率不一樣[6]。遲世春等[7]在甜菜上接種13份材料，其中1份未形成胚狀體，其余材料的誘導(dǎo)率為1.7%～16.3%。本試驗(yàn)在未授粉子房離體培養(yǎng)中采用基因型不同的3個(gè)西瓜品種作為試驗(yàn)材料，僅‘早春紅玉獲得了再生植株。說(shuō)明基因型是西瓜未授粉子房成功誘導(dǎo)的重要因素，所以還應(yīng)根據(jù)需要擴(kuò)大基因型的選擇范圍，以期篩選出容易誘導(dǎo)分化出完整植株的基因型。

3.3 胚囊發(fā)育時(shí)期對(duì)西瓜未授粉子房誘導(dǎo)率的影響

葛志東[2]在西葫蘆未授粉子房培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)胚珠發(fā)育程度決定了誘導(dǎo)率的高低，并以接近成熟的開(kāi)花前1 d的子房誘導(dǎo)效果最好。Tarek A[8]在西葫蘆上得出第2節(jié)位的雌花誘導(dǎo)率高于第1和第3節(jié)位的雌花。本試驗(yàn)從第2朵雌花開(kāi)放時(shí)開(kāi)始取樣，發(fā)現(xiàn)所采用的3個(gè)品種均以開(kāi)花前1 d的子房誘導(dǎo)率最高。但是周林[9]在研究中認(rèn)為西瓜開(kāi)花當(dāng)天的子房誘導(dǎo)率最高，這與本試驗(yàn)結(jié)果有一定的差異。可能是不同基因型品種的子房胚囊發(fā)育程度、生理狀況和內(nèi)源激素水平不一致所造成的。

3.4 外源激素對(duì)西瓜未授粉子房離體培養(yǎng)的影響

有研究表明，外源激素對(duì)未授粉子房的離體培養(yǎng)影響很大，且發(fā)現(xiàn)2，4-D是胚性愈傷組織形成所必需的[10]。葛志東[2]在西葫蘆研究中發(fā)現(xiàn)2，4-D、6-BA、NAA混合使用比單獨(dú)使用某種激素誘導(dǎo)率高。本試驗(yàn)也得出激素是未授粉子房離體培養(yǎng)必不可少的，在沒(méi)添加激素的培養(yǎng)基上3個(gè)供試品種都沒(méi)有獲得芽點(diǎn)。2，4-D對(duì)西瓜未授粉子房的誘導(dǎo)非常重要，其濃度決定了誘導(dǎo)率的高低。但在只添加2，4-D的培養(yǎng)基上，愈傷不分化，不能獲得芽點(diǎn)。所以一定濃度的6-BA和NAA也是西瓜未授粉子房培養(yǎng)所需要的。

3.5 再生植株倍性探討

許多研究者都采用染色體計(jì)數(shù)法進(jìn)行了植株的倍性鑒定[11-12]，本試驗(yàn)利用染色體計(jì)數(shù)法鑒定再生植株發(fā)現(xiàn)有單倍體、二倍體和四倍體，這與遲世春[7]在甜菜研究中所得到的結(jié)果一致。可能是單倍體在培養(yǎng)過(guò)程中自然加倍的結(jié)果，也可能是由珠被或者子房壁獲得的再生植株。因此，在未授粉子房離體培養(yǎng)中，如何防止體細(xì)胞產(chǎn)生植株是單倍體誘導(dǎo)的一大關(guān)鍵。

參考文獻(xiàn)

[1] 杜勝利. 黃瓜雌核發(fā)育及染色體倍性鑒定與加倍研究 [D]. 天津：南開(kāi)大學(xué)，2002.

[2] 葛志東. 西葫蘆未授粉子房離體培養(yǎng)研究[D]. 烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[3] 楊 穎. 西瓜離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)單倍體與甜瓜SSR標(biāo)記圖譜構(gòu)建[D]. 銀川：寧夏大學(xué)，2010.

[4] Gémes-Juhász A，Balogh P，F(xiàn)erenczy A，et al. Effect of optimal stage of female gametophyte and heat treatment on in vitro gynogenesis induction in cucumber（Cucumis sativus L.）[J]. Plant Cell Reports，2002，2（21）：105-111.

[5] 陳小鵬，劉栓桃，孫小鐳，等. 黃瓜未授粉子房的胚狀體誘導(dǎo)研究初報(bào)[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2005，14（2）： 148-151.

[6] 張伶俐，崔崇士，屈淑平. 植物離體雌核發(fā)育的研究進(jìn)展[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40（11）： 133-136

[7] 遲世春，卞桂杰，王景波，等. 甜菜未授粉胚珠培養(yǎng)技術(shù)研究[J]. 中國(guó)甜菜，1993（3）： 1-6.

[8] Shalaby T A. Factors affecting haploid induction through in vitro gynogenesis in summer squash（Cucurbita pepo L.）[J]. Scientia Horticulturae，2007，11（5）： 1-6.

[9] 周 林. 西瓜花藥、子房和子葉離體培養(yǎng)影響因素的研究[D]. 南寧：廣西大學(xué)，2009.

[10] 崔凱榮，邢更生，周功克，等. 植物激素對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)[J]. 遺傳學(xué)報(bào)，2000，22： 349-354.

[11] Kietkowska A，Adamus A. In vitro culture of unfertilized ovules in carrot（Daucus carota L.）[J]. Plant Cell，2010，3（102）： 309-319.

[12] 湯飛宇，丁 菲，王國(guó)英，等. 從玉米傳粉子房培養(yǎng)出單倍體植株[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，33（4）： 489-493.