禽流感不同檢測方法對比

李玉瑩

流感是一種歷史悠久的疾病，人類歷史上曾經多次流行并引起嚴重的后果，例如1918-1919年西班牙流感流行、1957-1958年始于中國貴州進而蔓延全球的流感疫情。到了1997年香港發生人感染H5N1禽流感事件，造成150萬只雞被宰殺，6人死亡；2003年亞洲地區H5N1禽流感爆發，人禽均出現死亡病例；2009年H1N1流感大流行，疫情席卷全球持續了一年多，出現疫情的國家和地區達到了214個，造成約1.85萬人死亡；2013年H7N9型禽流感在上海和安徽兩地率先發現，造成全國37人死亡。由資料可見，近幾年禽流感疫情發生頻率逐漸頻繁、流行范圍廣、破壞力強，文章比較禽流感不同檢測方法，旨在闡明各種檢測方法優、劣勢及適用范圍，力爭做到早發現、早確診、早治療，把危害降到最低。

疾病檢測首先要了解病原體特性，進而選擇特異性和敏感性的試驗方法。禽流感是由A型禽流感病毒引起的家禽和人類急性接觸性疾病，近年來以H5N1和H7N9發病次數多、致病力強，發病率和死亡率較高。禽流感病毒為正粘病毒科流感病毒屬、單鏈RNA、電鏡下外觀呈球形或多形態、直徑80～120 nm、有包膜、包膜上有血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）兩種糖蛋白突起為主要抗原成份。但HA和NA亞型眾多，而且各亞型或血清型之間無交叉反應性，這使得禽流感病毒的檢測工作較為困難。任何一種疾病檢測均分為病原學檢測和血清學檢測兩種方法，禽流感病原學檢測方法主要為電鏡直接觀察法和培養法，血清學常用檢測方法主要分為瓊脂擴散實驗、酶免實驗、金標快速實驗、免疫熒光實驗等。

1 病原學檢測

1.1 電鏡直接觀察法

取疑似感染的標本，以病毒分布較多的呼吸道及肺部取材，將標本處理后在電鏡下直觀觀察，根據禽流感病毒自身的形態、結構等不同特征，能很快做出診斷。但電鏡觀察結果與樣本制備技術、病料采集的部位和時間、檢測人員技術有關，且電鏡法不能用于亞型及致病性的測定，因此該技術可用于科研方面，臨床檢測應用較少。

1.2 培養法

病毒分離培養法是禽流感診斷的“金標準”，也可用于免疫禽群的監測手段。禽流感病毒培養實驗分為細胞培養法和雞胚培養法。細胞培養一般使用MDCK細胞，采用標本預處理、細胞接種、細胞病變觀察的過程，大多數病毒株的復制高峰約在感染后72 h。雞胚培養法一般選取9～11日齡SPF雞胚，疑似樣本加入雙抗研磨后離心取上清液，尿囊腔接種標本，24~120 h培養病毒。死亡雞胚尿囊液中若檢測出有凝血活性，可進一步確定分型。該方法特異性和敏感性較高，但操作相對繁瑣、檢測時間長、需要一周左右時間，因此不能用于常規快速檢測。

2 血清學檢測

2.1 瓊脂擴散實驗

瓊脂擴散實驗是利用可用性抗原和抗體在半固體瓊脂板中相向擴散，在比例合適處形成白色沉淀線。由于所有的禽流感病毒都具有型特異性共同抗原，可用一種AIV的抗原或抗血清對所有AIV的抗體或抗原（目前有15種血凝素亞型）進行鑒定。取疑似感染禽流感10 d左右的血清，與已知的禽流感抗原作瓊脂擴散試驗，如出現陽性反應，即可確診禽流感病毒感染。該方法缺點是時間過長,敏感不高，且不能區分動物血清抗體陽性是病毒感染所致還是計劃免疫所產生的抗體。

2.2 酶免實驗

酶聯免疫吸附試驗(Ezyme linked immunosor-bentassay, ELISA)是一種經典的檢測方法，通過辣根過氧化物酶標記抗原或抗體、在微孔板進行抗原抗體結合、通過底物顯色反應判斷結果，分為捕獲法、間接法、夾心法等，并可實現定性和定量，是檢測A型禽流感病毒和血清特異性抗體的一種特異、敏感、微量、快速的診斷技術，已成為AI流行病學及早期快速診斷的最有效和實用的方法。有研究表明ELISA方法相比較瓊脂擴散實驗、血凝實驗、補體結合實驗具備較高的敏感性。隨著檢測技術的不斷發展，已由早期的捕獲法、間接法發展到最近的夾心法。包被禽流感抗原、加入待檢標本、再加入酶標記抗原的雙抗原夾心法可用于禽流感特異性抗體的檢測，Watcharatanyatip 等建立了雙抗原夾心ELISA 來檢測A型流感病毒的抗體，以重組的A型流感病毒核蛋白作為捕獲抗原，而辣根過氧化物酶標記的抗原來檢測抗體，在運用該方法對125 份血清樣品的檢測中，敏感性和特異性分別為98%和97.3%，該方法能夠在接種后第4 天從感染鴨子中檢測出H5N1 亞型抗體，但此方法不能區分是自然感染還是免疫接種后產生的抗體。包被純化的禽流感病毒抗體、加入待檢標本、再加入酶標記抗體的雙抗體夾心法可用于禽流感抗原的檢測。肖云才等[1] 采用純化的H9N2亞型病毒免疫雞獲得了雞抗AIV 抗血清，由于在全病毒抗原中，具有型特異性的核蛋白抗原( NP) 、基質抗原(M ) 占了全病毒抗原的80%以上，亞型抗原只占整個抗原成分的16%左右，因此， 用雞抗禽流感高免血清作包被抗體，能查出所有A 型流感病毒。所以, 本試劑盒能查出所有亞型的AIV 感染，但不能確定是哪一種亞型。

2.3 金標快速實驗

膠體金技術是20世紀80年代發展起來的固相標記免疫測定技術，將抗原或單克隆抗體固定在層析介質上、以膠體金為標記物、應用免疫層析的原理,對抗原或抗體進行檢測。2006年蔡家利等[2]利用膠體金標記抗AIV單克隆抗體和羊抗AIV抗體建立了一種簡便、快速、準確的檢測動物禽流感病毒(AIV)的膠體金免疫層析法試劑盒，靈敏度可達10 ng/mL，與進口禽流感膠體金免疫層析試劑條比較,符合率達100%。2008年艾嘉亮[3]以膠體金顆粒標記針對M蛋白單克隆抗體,以多克隆抗體(禽流感病毒的羊血清)作為檢測線捕獲抗體建立了檢測通用型禽流感病毒的雙抗體夾心膠體金免疫層析方法。5 min可出結果，和其他禽類病毒沒有明顯的交叉反應性。免疫膠體金試紙條檢測禽流感可以現場操作，直接取喉氣管棉拭子進行檢測，無須儀器設備，操作簡單，可廣泛用于流感病毒的早期診斷。缺點是對禽流感檢測的敏感性較低(10 ng/mL) ,容易漏檢或假陽性,不易定量,不方便大批量的集約操作。

2.4 免疫熒光實驗

免疫熒光實驗是利用熒光素作為標記物，熒光素標記的抗原(或抗體)特異性地與抗體(或抗原)結合，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應來進行觀察。IFA包括直接熒光抗體法和間接熒光抗體法，后者較常用。IFA 最早應用熒光標記禽流感病毒核糖蛋白(NP)或基質蛋白(MP)抗體檢測組織觸片中的禽流感病毒。2008年白泉陽等[4]以雞抗禽流感抗體和兔抗雞熒光抗體進行間接免疫熒光試驗(IFA)，結果于細胞核、細胞質內觀察到特異性的熒光。該方法具有快速、簡便、敏感性高等特點，但由于標本前處理較為復雜，且需要特殊的熒光顯微鏡和有經驗的實驗操作人員，臨床應用較少。■（編輯：狄慧）

參考文獻：

[1] 肖運才,畢丁仁,李自力,等.禽流感病毒夾心ELISA 診斷試劑盒的研制及應用[J].中國獸醫學報, 2005,25(6):570-572.

[2] 蔡家利,吳勝昔, 胡仁建,等.膠體金免疫層析法快速診斷禽流感[J].重慶工學院學報, 2006(11):4-7.

[3] 艾嘉亮.通用型禽流感病毒膠體金免疫層析診斷方法的建立[D].哈爾濱:東北農業大學.2008.

[4] 白泉陽,孫穎杰,鄭騰,等.H9亞型禽流感病毒間接免疫熒光檢測方法的建立與比較[J].福建農業學報,2008(2):146-148.