雙抗體夾心ELISA在轉基因生物檢測中的應用研究

薛振華　史文清　王曉鳳　云鵬

摘要隨著轉基因產品種類和數量的不斷增加，轉基因生物及其產品的安全性也越來越受到關注，各國一直以來也都高度重視轉基因生物及產品的管理。作為轉基因生物安全評價的第一步，轉基因生物的準確檢測顯得格外重要。該文綜述了雙抗夾心ELISA方法的原理、技術要點及其在轉基因植物及產品檢測中的應用，并對該方法在轉基因動物檢測中的應用前景進行分析，為雙抗夾心ELISA方法的合理利用提供依據。

關鍵詞雙抗體夾心ELISA；轉基因生物；轉基因；檢測

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）12-03476-01

基金項目北京市農業(yè)局科技新星計劃項目（20120309）；現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系北京市生豬創(chuàng)新團隊建設項目。

作者簡介薛振華（1983- ），男，山東梁山人，畜牧師，從事畜禽繁殖生物技術研究。*通訊作者，從事生物技術研究。

收稿日期20131227轉基因產品的檢測與管理是世界性重大科技問題之一，同時也是一個關乎政治、經濟、貿易等多重領域的敏感問題。自1994年美國實現(xiàn)了轉基因番茄的首次商業(yè)化之后，轉基因生物技術如今已被廣泛應用于現(xiàn)代農業(yè)[1]。目前，在全球范圍內，已有29個國家種植了轉基因作物，被批準商業(yè)化的轉基因生物超過100種，種植面積達到16 000萬hm2[2]。很多國家將已批準的部分轉基因作物作為食品或飼料的生產原料，與此同時，轉基因產品的安全性受到了廣泛關注[3]。迄今關于轉基因產品的安全性問題仍有爭論，因此需要建立轉基因產品的檢測技術平臺，多方位、長期、系統(tǒng)的監(jiān)測和評價其安全性。

轉基因生物檢測主要包括基因水平檢測和蛋白質水平檢測，也包括化學組織檢測、生物測定檢測和免疫熒光檢測等。其中轉基因生物基因水平檢測包括定性PCR 檢測[4]、定量PCR檢測、RTPCR檢測、Southern blot檢測、Northern分析法和基因芯片檢測等。轉基因生物蛋白質水平檢測包括Western blot檢測、ELISA檢測[5]、試紙條檢測[6]、雙向電泳檢測和蛋白芯片檢測等。雙抗體夾心ELISA檢測方法具有準確性和靈敏度高、適用范圍廣和檢測速度快的優(yōu)點。筆者著重介紹該方法在轉基因植物檢測中的應用，以期為轉基因動物及其產品的檢測提供參考。

1雙抗體夾心ELISA檢測方法的原理和基本步驟

ELISA檢測方法分為直接ELISA檢測方法、間接ELISA檢測方法、雙抗體夾心ELISA檢測方法和競爭ELISA檢測方法等；其中雙抗體夾心ELISA法是檢測抗原最常用的方法。雙抗體夾心ELISA包括直接夾心ELISA方法和間接夾心ELISA方法。直接夾心ELISA的基本步驟是將特異性抗體包被固相載體，形成固相抗體，又稱捕獲抗體，洗滌除去未結合的抗體及雜質；加待檢測樣本，使之與固相抗體接觸反應一段時間（37 ℃或室溫反應1 h），讓樣本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原抗體免疫復合物；洗滌除去其他未結合的物質，加入酶標特異性抗體，即檢測抗體，使固相免疫復合物上的抗原與酶標記抗體結合，徹底洗除未結合的酶標記抗體，此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量成正比；加入顯色底物，免疫復合物中的酶催化底物形成有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的判斷。

2雙抗體夾心ELISA檢測方法的技術要點

在ELISA實施過程中，包被于固相載體表面的抗體的來源和制備方法對試驗結果都有影響，抗體的質量是試驗成功與否的關鍵因素。ELISA方法要求捕獲抗體效價高、親和力強。用于ELISA的抗體有多克隆抗體和單克隆抗體，抗血清成分復雜，應從中提取IgG才可用于包被固相載體；含單克隆抗體的小鼠腹水中的特異性抗體含量較高，有時可適當稀釋后直接進行包被。直接夾心ELISA方法，檢測抗體是酶標記的特異性抗體，酶標記的抗體也稱為結合物。制備抗體酶結合物的方法通常有戊二醛法和過碘酸鹽法，用于制備酶結合物用的抗體要求有較高的純度。間接夾心ELISA法，不需要對檢測抗體進行酶標記，只需購買商品化二抗結合檢測抗體即可。夾心ELISA反應條件的選擇，包括捕獲抗體包被濃度的選擇、酶標記物稀釋濃度的選擇、作用時間及其他影響方法靈敏度的條件的選擇[7-8]。

3雙抗體夾心ELISA方法在轉基因植物及產品檢測中的應用

ELISA技術以其高靈敏度、高特異性的特點被廣泛應用于轉基因植物及其產品的檢測，是1對針對轉基因植物中外源基因的表達產物來進行檢測的技術方法。常見的外源蛋白檢測方法為雙抗體夾心ELISA檢測方法。