雙抗體夾心ELISA在轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)中的應(yīng)用研究

薛振華　史文清　王曉鳳　云鵬

摘要隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品種類和數(shù)量的不斷增加，轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的安全性也越來越受到關(guān)注，各國(guó)一直以來也都高度重視轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品的管理。作為轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)的第一步，轉(zhuǎn)基因生物的準(zhǔn)確檢測(cè)顯得格外重要。該文綜述了雙抗夾心ELISA方法的原理、技術(shù)要點(diǎn)及其在轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品檢測(cè)中的應(yīng)用，并對(duì)該方法在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物檢測(cè)中的應(yīng)用前景進(jìn)行分析，為雙抗夾心ELISA方法的合理利用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞雙抗體夾心ELISA；轉(zhuǎn)基因生物；轉(zhuǎn)基因；檢測(cè)

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）12-03476-01

基金項(xiàng)目北京市農(nóng)業(yè)局科技新星計(jì)劃項(xiàng)目（20120309）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市生豬創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介薛振華（1983- ），男，山東梁山人，畜牧師，從事畜禽繁殖生物技術(shù)研究。*通訊作者，從事生物技術(shù)研究。

收稿日期20131227轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)與管理是世界性重大科技問題之一，同時(shí)也是一個(gè)關(guān)乎政治、經(jīng)濟(jì)、貿(mào)易等多重領(lǐng)域的敏感問題。自1994年美國(guó)實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因番茄的首次商業(yè)化之后，轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)如今已被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)[1]。目前，在全球范圍內(nèi)，已有29個(gè)國(guó)家種植了轉(zhuǎn)基因作物，被批準(zhǔn)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因生物超過100種，種植面積達(dá)到16 000萬hm2[2]。很多國(guó)家將已批準(zhǔn)的部分轉(zhuǎn)基因作物作為食品或飼料的生產(chǎn)原料，與此同時(shí)，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性受到了廣泛關(guān)注[3]。迄今關(guān)于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性問題仍有爭(zhēng)論，因此需要建立轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，多方位、長(zhǎng)期、系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)其安全性。

轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)主要包括基因水平檢測(cè)和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)，也包括化學(xué)組織檢測(cè)、生物測(cè)定檢測(cè)和免疫熒光檢測(cè)等。其中轉(zhuǎn)基因生物基因水平檢測(cè)包括定性PCR 檢測(cè)[4]、定量PCR檢測(cè)、RTPCR檢測(cè)、Southern blot檢測(cè)、Northern分析法和基因芯片檢測(cè)等。轉(zhuǎn)基因生物蛋白質(zhì)水平檢測(cè)包括Western blot檢測(cè)、ELISA檢測(cè)[5]、試紙條檢測(cè)[6]、雙向電泳檢測(cè)和蛋白芯片檢測(cè)等。雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法具有準(zhǔn)確性和靈敏度高、適用范圍廣和檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)。筆者著重介紹該方法在轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)中的應(yīng)用，以期為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其產(chǎn)品的檢測(cè)提供參考。

1雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的原理和基本步驟

ELISA檢測(cè)方法分為直接ELISA檢測(cè)方法、間接ELISA檢測(cè)方法、雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法和競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法等；其中雙抗體夾心ELISA法是檢測(cè)抗原最常用的方法。雙抗體夾心ELISA包括直接夾心ELISA方法和間接夾心ELISA方法。直接夾心ELISA的基本步驟是將特異性抗體包被固相載體，形成固相抗體，又稱捕獲抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)；加待檢測(cè)樣本，使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間（37 ℃或室溫反應(yīng)1 h），讓樣本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體免疫復(fù)合物；洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)，加入酶標(biāo)特異性抗體，即檢測(cè)抗體，使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)記抗體結(jié)合，徹底洗除未結(jié)合的酶標(biāo)記抗體，此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成正比；加入顯色底物，免疫復(fù)合物中的酶催化底物形成有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的判斷。

2雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的技術(shù)要點(diǎn)

在ELISA實(shí)施過程中，包被于固相載體表面的抗體的來源和制備方法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果都有影響，抗體的質(zhì)量是試驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵因素。ELISA方法要求捕獲抗體效價(jià)高、親和力強(qiáng)。用于ELISA的抗體有多克隆抗體和單克隆抗體，抗血清成分復(fù)雜，應(yīng)從中提取IgG才可用于包被固相載體；含單克隆抗體的小鼠腹水中的特異性抗體含量較高，有時(shí)可適當(dāng)稀釋后直接進(jìn)行包被。直接夾心ELISA方法，檢測(cè)抗體是酶標(biāo)記的特異性抗體，酶標(biāo)記的抗體也稱為結(jié)合物。制備抗體酶結(jié)合物的方法通常有戊二醛法和過碘酸鹽法，用于制備酶結(jié)合物用的抗體要求有較高的純度。間接夾心ELISA法，不需要對(duì)檢測(cè)抗體進(jìn)行酶標(biāo)記，只需購(gòu)買商品化二抗結(jié)合檢測(cè)抗體即可。夾心ELISA反應(yīng)條件的選擇，包括捕獲抗體包被濃度的選擇、酶標(biāo)記物稀釋濃度的選擇、作用時(shí)間及其他影響方法靈敏度的條件的選擇[7-8]。

3雙抗體夾心ELISA方法在轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品檢測(cè)中的應(yīng)用

ELISA技術(shù)以其高靈敏度、高特異性的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的檢測(cè)，是1對(duì)針對(duì)轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的表達(dá)產(chǎn)物來進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)方法。常見的外源蛋白檢測(cè)方法為雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法。