玉米和擬南芥的原生質(zhì)體制備及瞬時(shí)表達(dá)體系的研究

趙蘇州　盧運(yùn)明　張占路　趙楊敏　王磊

摘要[目的]優(yōu)化玉米和擬南芥原生質(zhì)體的制備條件及瞬時(shí)表達(dá)體系。[方法]以不同時(shí)期玉米葉片和擬南芥為材料分離原生質(zhì)體，通過對(duì)不同酶濃度，解離時(shí)間和滲透壓的研究，優(yōu)化最佳分離原生質(zhì)體體系；原生質(zhì)體再經(jīng)PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，通過GFP基因表達(dá)百分比鑒定原生質(zhì)體活性和轉(zhuǎn)化效率。[結(jié)果]玉米和擬南芥原生質(zhì)分離的最佳條件為：纖維素酶1.5%， 離析酶0.5%；擬南芥酶解4 h，甘露醇濃度0.4 mol/L；玉米酶解6 h，甘露醇濃度0.45～0.50 mol/L。最佳生長時(shí)期為：擬南芥6～8片葉；玉米二片葉。用去內(nèi)毒素質(zhì)粒經(jīng)PEG（玉米30% PEG，擬南芥40% PEG）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化置于黑暗下培養(yǎng)，原生質(zhì)體活性和轉(zhuǎn)化效率較高，原生質(zhì)體中可以觀察到明顯的GFP熒光。[結(jié)論]玉米和擬南芥原生質(zhì)體的制備受酶濃度，解離時(shí)間和滲透壓的影響，在原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化過程中，質(zhì)粒DNA純度，PEG濃度等是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素，與擬南芥原生質(zhì)體相比玉米原生質(zhì)體要穩(wěn)定性差一些。

關(guān)鍵詞玉米；原生質(zhì)體； 擬南芥

中圖分類號(hào)S513；Q819文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）12-03479-04

基金項(xiàng)目國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2011ZX08003-002）。

作者簡介趙蘇州（1988-），男，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向：植物轉(zhuǎn)錄因子。*通訊作者，研究員，博士，從事植物基因沉默研究。

植物原生質(zhì)體是指植物細(xì)胞通過機(jī)械或酶解等特殊方法脫去細(xì)胞壁后，留下的裸露、具有生活力、被細(xì)胞膜所包圍的原生質(zhì)團(tuán)。原生質(zhì)體由于沒有細(xì)胞壁，可相對(duì)容易攝取外源DNA、質(zhì)粒、病毒顆粒等外源遺傳物質(zhì)，是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體；同時(shí)，原生質(zhì)體也是獲得細(xì)胞無性系和選育突變體的優(yōu)良起始材料；還可通過誘導(dǎo)形成雜種細(xì)胞，為創(chuàng)造新雜種開辟了途徑。酶解法作為現(xiàn)在最常用的的方法，通過纖維素酶和離析酶將植物細(xì)胞裂解為均一的單細(xì)胞體系，能獲得完整和高活性的原生質(zhì)體[1-2]。純化后植物原生質(zhì)體可按既定方向進(jìn)行培養(yǎng)，使原生質(zhì)體適合于遺傳轉(zhuǎn)化、細(xì)胞融合、生理研究、體胚發(fā)生、器官發(fā)生等操作[3]。因此，原生質(zhì)體的制備是其中最關(guān)鍵的一部，如何獲得完整且活性較高的原生質(zhì)體是各項(xiàng)工作的起始。在植物快速繁殖、植物遠(yuǎn)緣遺傳重組、轉(zhuǎn)基因以及品種改良和創(chuàng)造新類型等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

原生質(zhì)體作為常用的植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，植物中瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)具有檢測(cè)速度快、轉(zhuǎn)化簡單等特點(diǎn)，結(jié)合報(bào)告基因RFP、YFP、GUS[4]、GFP[5]、EGFP[6]等的使用，該技術(shù)被廣泛地用于基因功能分析的研究，如基因表達(dá)、蛋白亞細(xì)胞定位、染色質(zhì)免疫沉淀、蛋白活性檢測(cè)以及蛋白間互作等[7]。原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)相繼建立，為研究蛋白的亞細(xì)胞定位和基因的表達(dá)調(diào)控提供了方便而有效的試驗(yàn)系統(tǒng)。玉米和擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系可以對(duì)研究基因的功能和調(diào)控途徑的研究具有重要意義。筆者用玉米和擬南芥相互對(duì)照分離和純化，以期獲得高產(chǎn)接高活力的原生質(zhì)體，再通過PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法，成功建立玉米和擬南芥葉肉原生質(zhì)體較高效的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。選取玉米（Zea mays L.）自交系宗31飽滿的種子，用10%過氧化氫消毒，用滅菌水沖洗3次置于發(fā)芽機(jī)，生長5 d，待胚芽長至約2 cm，移置營養(yǎng)土中，置于溫室培養(yǎng)1周左右，長至2葉期和3葉期，選取第2片伸展的葉子作為提取玉米原生質(zhì)體的材料。

1.1.2 主要試劑。氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣、甘露醇、葡萄糖、MES、PEG 4000，購自Sigma公司；Cellulase R10和Macerozyme R10，均購自Japan Yakult Honsha， Tokyo；金牌超量無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（Lot：00071309），購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原生質(zhì)體的制備。擬南芥先用無水乙醇洗5 min，然后再用75%的乙醇加0.1%Triton100洗3 min，分別用95%乙醇再洗1遍，晾干后播種與1/2MS中，在溫度22 ℃/18 ℃光照14/10 h周期下7 d左右，移栽至營養(yǎng)土中，分別取到8～10片葉和12～14片葉期的擬南芥，取擬南芥葉片作為原生質(zhì)體。

1.2.2 質(zhì)粒提取。pCAMBIA1303表達(dá)框由花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動(dòng)子、GFP報(bào)告基因、胭脂堿合成酶終止子（NOS）構(gòu)成。按照說明書用康為世紀(jì)無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒抽提質(zhì)粒，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶解液配置。取0.5%～2.0%纖維素酶R10，05%～1.5%離析酶R10，0.3～0.6 mmol/L D甘露醇，20 mmol/L KCl，20 mmol/L MES（pH 5.7）混合液置于55 ℃水浴10 min，冷卻至室溫后，加入10 mmol/L CaCl2，0.1% BSA，并用0.45 μm濾膜過濾到培養(yǎng)皿中。

1.2.4 原生質(zhì)體制備和產(chǎn)量的測(cè)定。將玉米葉片和擬南芥葉片去兩端切成約0.5～1.0 mm細(xì)絲，把切好的葉片放入含有酶解液，室溫黑暗中振蕩（轉(zhuǎn)速為40 r/min）酶解（2～7 h）。顯微鏡下檢查溶液中的原生質(zhì)體，玉米葉肉原生質(zhì)體大小大約30～40 μm，擬南芥葉肉原生質(zhì)體大小大約30～50 μm。在過濾除去未溶解的葉片前用等量的W5[2 mmol/L MES（pH 5.7），154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl]溶液稀釋含有原生質(zhì)體的酶液。先用W5溶液潤濕35～75 μm的尼龍膜或60～100目篩子，然后用其過濾含有原生質(zhì)體的酶解液。將過濾后的綠色混合物置于40 ml圓底離心管中，400 r/min，2 min。洗滌沉淀1次，離心后棄上清液，再次加入W5，重懸沉淀，置于冰上30 min。再次400 r/min離心2 min，棄上清液，加入適量的MMg溶液（4 mmol/L MES，0.4 mmol/L D甘露醇，15 mmol/L MgCl2），備用。參考侯歲穩(wěn)的原生質(zhì)體簡易計(jì)數(shù)方法[8]。

1.2.5 PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)。吸取10 μg質(zhì)粒于2 ml圓底離心管中，加入制備好的100 μl原生質(zhì)體溶液混勻，原生質(zhì)體加入等體積30%～50% PEG-Ca2+溶液[PEG4000（m/v），200 mmol/L甘露醇，100 mmol/L CaCl2]，將混合物用2倍體積的W5溶液清洗2次，最后加入500 μl W5溶液置于室溫、弱光下培養(yǎng)15 h。轉(zhuǎn)化GFP融合載體的原生質(zhì)體培養(yǎng)過夜后用Leica激光共聚焦顯微鏡SP5觀測(cè)熒光分布[9-10]。

2結(jié)果與分析

2.1酶液濃度對(duì)原生質(zhì)體分離的影響 在含不同濃度組合的酶解液中黑暗裂解（擬南芥4 h，玉米6 h），其原生質(zhì)體的分離情況見表1。由表1可知，隨著酶濃度的不斷增加，玉米和擬南芥葉肉原生質(zhì)體的產(chǎn)量逐漸提高。當(dāng)2種酶的濃度達(dá)到1.5%和0.5%以上后，原生質(zhì)體的產(chǎn)量增加不明顯。擬南芥中當(dāng)兩種酶的濃度均達(dá)到1.5%以上后，原生質(zhì)體的產(chǎn)量逐漸減少，碎片也較多。玉米中情況稍微有點(diǎn)差別，在2種酶濃度均達(dá)到1.5%或2.0%，1.0%以上后，原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸減少，碎片也較多。因此，從原生質(zhì)體的產(chǎn)量、細(xì)胞碎片的多少及酶的使用量等多方面綜合考慮，擬南芥葉肉原生質(zhì)體分離的最佳的酶類組合為纖維素酶1.5%，離析酶0.5%，玉米原生質(zhì)體則有2個(gè)選擇，1個(gè)和擬南芥相同，產(chǎn)量較多，碎片少，另外纖維素酶2%，離析酶0.5%，產(chǎn)量最多，碎片稍微增多。

2.2酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體分離的影響 試驗(yàn)比較了酶解2、3、4、5和6 h對(duì)擬南芥和玉米葉肉原生質(zhì)體分離效果的影響，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，隨著酶解時(shí)間的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量不斷提高，酶解4 h時(shí)，擬南芥原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，達(dá)（7.0±1.2）×105/ml，玉米則繼續(xù)增加，在6 h使玉米產(chǎn)量最高，達(dá)（6.0±2.1）×105/ml。當(dāng)達(dá)到最大產(chǎn)量后，葉肉細(xì)胞已趨于完全解離，酶液中葉片成透明狀。酶解時(shí)間繼續(xù)增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量反而下降。究其原因可能是由于長時(shí)間的酶解使一部分已解離的原生質(zhì)受到損傷進(jìn)而解體的緣故。

2.4PEG濃度對(duì)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的影響 PEG4000（聚乙二醇4000）分子能改變各類細(xì)胞的生物膜結(jié)構(gòu)，使2細(xì)胞接觸點(diǎn)處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，原生質(zhì)體體表面的負(fù)電荷在鈣離子的連接下，形成靜電鍵，降低細(xì)胞表面的極性，促使之間粘著和結(jié)合，在高pH、高鈣離子的作用下，鈣離子和結(jié)合在質(zhì)膜上的PEG被洗脫，導(dǎo)致電荷平衡失調(diào)并重新分配，使2種原生質(zhì)體形成具有共同質(zhì)膜的融合體。由表4可知，試驗(yàn)選用PEG4000對(duì)擬南芥葉肉原生質(zhì)休進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PEG4000濃度發(fā)生變化時(shí)，轉(zhuǎn)化效率也隨之發(fā)生變化。PEG濃度為20%時(shí)，擬南芥轉(zhuǎn)化效率僅有9%，隨著PEG濃度的升高轉(zhuǎn)化效率也隨之升高；當(dāng)PEG濃度為40%時(shí)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到67%（圖1A）。玉米中在PEG濃度20%時(shí)轉(zhuǎn)化效率有17%，在30%和35%時(shí)轉(zhuǎn)化效率達(dá)到了45%左右（圖1B），且細(xì)胞碎片較少，PEG濃度在增加雖增加了轉(zhuǎn)化效率，但是細(xì)胞碎片開始增多。PEG的濃度越高，其對(duì)細(xì)胞的影響也越來越大，因?yàn)镻EG對(duì)細(xì)胞有一定的毒害作用，高濃度下常致使細(xì)胞發(fā)生破碎。另外，PEG的物理化學(xué)性質(zhì)決定了其在較高濃度下（大于或等于50%）很難溶解，所以在較高濃度下不便于試驗(yàn)操作。所以在轉(zhuǎn)化擬南芥和玉米原生質(zhì)體時(shí)，試驗(yàn)選擇了40%和30%的溶液，以達(dá)到最好的效果。在培養(yǎng)16 h后用激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)擬南芥轉(zhuǎn)化效率（67%）比玉米轉(zhuǎn)化效率（45%）高，細(xì)胞碎片比玉米少。

3結(jié)論與討論

酶解去壁對(duì)植物細(xì)胞是一個(gè)嚴(yán)重的機(jī)械損傷和生理損傷過程[11]。原生質(zhì)體適宜的分離條件要求既能將細(xì)胞壁完全去除，又要盡量減少對(duì)原生質(zhì)體的損傷。采用酶解法來游離煙草葉肉原生質(zhì)體時(shí)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)酶液的濃度、酶液的處理時(shí)間及其滲透壓等對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化活力等都有很大的影響。日本生產(chǎn)的纖維素酶（ Cellulase R10）和離析酶（M acerozyme R10）效果最佳，酶濃度經(jīng)過組合分析，發(fā)現(xiàn)擬南芥在1.5% Cellulase R10，0.5% Mecerozyme R10時(shí)裂解比較完全并且細(xì)胞碎片比較少，玉米在1.5% Cellulase R10，0.5% Mecerozyme R10時(shí)裂解也比較完全。在據(jù)以往的報(bào)道，滲透壓穩(wěn)定劑一般是用甘露醇、山梨醇、蔗糖或葡萄糖等，試驗(yàn)過程中用甘露醇滲透壓穩(wěn)定劑， 結(jié)果是在擬南芥當(dāng)甘露醇濃度為0.40 mol/L時(shí)原生質(zhì)體游離效果最為理想，玉米以濃度為0.45～0.50 mol/L的甘露醇做酶液的滲透壓穩(wěn)定劑時(shí)效果最理想。酶解處理一般靜置在黑暗中進(jìn)行，擬南芥和玉米在未去表皮情況下酶解時(shí)間分別以4和6 h最佳，如果超過時(shí)間，原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化活力就會(huì)明顯降低，細(xì)胞碎片增多。

在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過程，PEG濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體狀態(tài)有很大的影響，擬南芥在40%或者45%濃度下可以獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，玉米在30%可以獲得較高的轉(zhuǎn)化效率和保持穩(wěn)定的原生質(zhì)體。玉米原生質(zhì)體比擬南芥原生質(zhì)體容易皺縮破裂，玉米一般在16 h后就開始破裂，而擬南芥在4 ℃卻可以保持48 h以上還可以看到GFP。還有材料狀態(tài)、質(zhì)粒純度和培養(yǎng)過程，都會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化效率有很大影響。尤其是在雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過程，需要較高的轉(zhuǎn)化效率，最后是用氯化銫超速離心法提取超純質(zhì)粒。酶解后的原生質(zhì)體失去了細(xì)胞壁的保護(hù)，極易受滲透壓變化的影響而導(dǎo)致破裂，因此在制備原生質(zhì)體的過程中，要保證酶解液等所用溶液的滲透壓盡量接近在玉米葉肉細(xì)胞自身的滲透勢(shì)，避免細(xì)胞吸水脹破或者失水皺縮；所有的操作過程都要輕柔，尤其是用移液槍吸取和離心速度要控制好，以防止因劇烈震蕩而導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂；在原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化過程中，PEGCa2+濃度（玉米30%和擬南芥40%）、質(zhì)粒DNA純度，PEG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化時(shí)間等是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素。

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