玉米和擬南芥的原生質體制備及瞬時表達體系的研究

趙蘇州　盧運明　張占路　趙楊敏　王磊

摘要[目的]優化玉米和擬南芥原生質體的制備條件及瞬時表達體系。[方法]以不同時期玉米葉片和擬南芥為材料分離原生質體，通過對不同酶濃度，解離時間和滲透壓的研究，優化最佳分離原生質體體系；原生質體再經PEG介導的轉化，通過GFP基因表達百分比鑒定原生質體活性和轉化效率。[結果]玉米和擬南芥原生質分離的最佳條件為：纖維素酶1.5%， 離析酶0.5%；擬南芥酶解4 h，甘露醇濃度0.4 mol/L；玉米酶解6 h，甘露醇濃度0.45～0.50 mol/L。最佳生長時期為：擬南芥6～8片葉；玉米二片葉。用去內毒素質粒經PEG（玉米30% PEG，擬南芥40% PEG）誘導轉化置于黑暗下培養，原生質體活性和轉化效率較高，原生質體中可以觀察到明顯的GFP熒光。[結論]玉米和擬南芥原生質體的制備受酶濃度，解離時間和滲透壓的影響，在原生質體轉化過程中，質粒DNA純度，PEG濃度等是影響轉化效率的關鍵因素，與擬南芥原生質體相比玉米原生質體要穩定性差一些。

關鍵詞玉米；原生質體； 擬南芥

中圖分類號S513；Q819文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）12-03479-04

基金項目國家轉基因生物新品種培育重大專項（2011ZX08003-002）。

作者簡介趙蘇州（1988-），男，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向：植物轉錄因子。*通訊作者，研究員，博士，從事植物基因沉默研究。

植物原生質體是指植物細胞通過機械或酶解等特殊方法脫去細胞壁后，留下的裸露、具有生活力、被細胞膜所包圍的原生質團。原生質體由于沒有細胞壁，可相對容易攝取外源DNA、質粒、病毒顆粒等外源遺傳物質，是進行遺傳轉化的理想受體；同時，原生質體也是獲得細胞無性系和選育突變體的優良起始材料；還可通過誘導形成雜種細胞，為創造新雜種開辟了途徑。酶解法作為現在最常用的的方法，通過纖維素酶和離析酶將植物細胞裂解為均一的單細胞體系，能獲得完整和高活性的原生質體[1-2]。純化后植物原生質體可按既定方向進行培養，使原生質體適合于遺傳轉化、細胞融合、生理研究、體胚發生、器官發生等操作[3]。因此，原生質體的制備是其中最關鍵的一部，如何獲得完整且活性較高的原生質體是各項工作的起始。在植物快速繁殖、植物遠緣遺傳重組、轉基因以及品種改良和創造新類型等方面具有廣闊的應用前景。

原生質體作為常用的植物瞬時表達系統，植物中瞬時表達系統具有檢測速度快、轉化簡單等特點，結合報告基因RFP、YFP、GUS[4]、GFP[5]、EGFP[6]等的使用，該技術被廣泛地用于基因功能分析的研究，如基因表達、蛋白亞細胞定位、染色質免疫沉淀、蛋白活性檢測以及蛋白間互作等[7]。原生質體瞬時表達系統相繼建立，為研究蛋白的亞細胞定位和基因的表達調控提供了方便而有效的試驗系統。玉米和擬南芥原生質體轉化體系可以對研究基因的功能和調控途徑的研究具有重要意義。筆者用玉米和擬南芥相互對照分離和純化，以期獲得高產接高活力的原生質體，再通過PEG介導轉化的方法，成功建立玉米和擬南芥葉肉原生質體較高效的瞬時表達系統。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。選取玉米（Zea mays L.）自交系宗31飽滿的種子，用10%過氧化氫消毒，用滅菌水沖洗3次置于發芽機，生長5 d，待胚芽長至約2 cm，移置營養土中，置于溫室培養1周左右，長至2葉期和3葉期，選取第2片伸展的葉子作為提取玉米原生質體的材料。

1.1.2 主要試劑。氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣、甘露醇、葡萄糖、MES、PEG 4000，購自Sigma公司；Cellulase R10和Macerozyme R10，均購自Japan Yakult Honsha， Tokyo；金牌超量無內毒素質粒大提試劑盒（Lot：00071309），購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原生質體的制備。擬南芥先用無水乙醇洗5 min，然后再用75%的乙醇加0.1%Triton100洗3 min，分別用95%乙醇再洗1遍，晾干后播種與1/2MS中，在溫度22 ℃/18 ℃光照14/10 h周期下7 d左右，移栽至營養土中，分別取到8～10片葉和12～14片葉期的擬南芥，取擬南芥葉片作為原生質體。

1.2.2 質粒提取。pCAMBIA1303表達框由花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子、GFP報告基因、胭脂堿合成酶終止子（NOS）構成。按照說明書用康為世紀無內毒素質粒大提試劑盒抽提質粒，-20 ℃保存備用。

1.2.3 酶解液配置。取0.5%～2.0%纖維素酶R10，05%～1.5%離析酶R10，0.3～0.6 mmol/L D甘露醇，20 mmol/L KCl，20 mmol/L MES（pH 5.7）混合液置于55 ℃水浴10 min，冷卻至室溫后，加入10 mmol/L CaCl2，0.1% BSA，并用0.45 μm濾膜過濾到培養皿中。

1.2.4 原生質體制備和產量的測定。將玉米葉片和擬南芥葉片去兩端切成約0.5～1.0 mm細絲，把切好的葉片放入含有酶解液，室溫黑暗中振蕩（轉速為40 r/min）酶解（2～7 h）。顯微鏡下檢查溶液中的原生質體，玉米葉肉原生質體大小大約30～40 μm，擬南芥葉肉原生質體大小大約30～50 μm。在過濾除去未溶解的葉片前用等量的W5[2 mmol/L MES（pH 5.7），154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl]溶液稀釋含有原生質體的酶液。先用W5溶液潤濕35～75 μm的尼龍膜或60～100目篩子，然后用其過濾含有原生質體的酶解液。將過濾后的綠色混合物置于40 ml圓底離心管中，400 r/min，2 min。洗滌沉淀1次，離心后棄上清液，再次加入W5，重懸沉淀，置于冰上30 min。再次400 r/min離心2 min，棄上清液，加入適量的MMg溶液（4 mmol/L MES，0.4 mmol/L D甘露醇，15 mmol/L MgCl2），備用。參考侯歲穩的原生質體簡易計數方法[8]。

1.2.5 PEG介導原生質體轉化和激光共聚焦顯微鏡檢測。吸取10 μg質粒于2 ml圓底離心管中，加入制備好的100 μl原生質體溶液混勻，原生質體加入等體積30%～50% PEG-Ca2+溶液[PEG4000（m/v），200 mmol/L甘露醇，100 mmol/L CaCl2]，將混合物用2倍體積的W5溶液清洗2次，最后加入500 μl W5溶液置于室溫、弱光下培養15 h。轉化GFP融合載體的原生質體培養過夜后用Leica激光共聚焦顯微鏡SP5觀測熒光分布[9-10]。

2結果與分析

2.1酶液濃度對原生質體分離的影響 在含不同濃度組合的酶解液中黑暗裂解（擬南芥4 h，玉米6 h），其原生質體的分離情況見表1。由表1可知，隨著酶濃度的不斷增加，玉米和擬南芥葉肉原生質體的產量逐漸提高。當2種酶的濃度達到1.5%和0.5%以上后，原生質體的產量增加不明顯。擬南芥中當兩種酶的濃度均達到1.5%以上后，原生質體的產量逐漸減少，碎片也較多。玉米中情況稍微有點差別，在2種酶濃度均達到1.5%或2.0%，1.0%以上后，原生質體產量逐漸減少，碎片也較多。因此，從原生質體的產量、細胞碎片的多少及酶的使用量等多方面綜合考慮，擬南芥葉肉原生質體分離的最佳的酶類組合為纖維素酶1.5%，離析酶0.5%，玉米原生質體則有2個選擇，1個和擬南芥相同，產量較多，碎片少，另外纖維素酶2%，離析酶0.5%，產量最多，碎片稍微增多。

2.2酶解時間對原生質體分離的影響 試驗比較了酶解2、3、4、5和6 h對擬南芥和玉米葉肉原生質體分離效果的影響，結果見表2。結果表明，隨著酶解時間的增加，原生質體產量不斷提高，酶解4 h時，擬南芥原生質體產量最高，達（7.0±1.2）×105/ml，玉米則繼續增加，在6 h使玉米產量最高，達（6.0±2.1）×105/ml。當達到最大產量后，葉肉細胞已趨于完全解離，酶液中葉片成透明狀。酶解時間繼續增加，原生質體產量反而下降。究其原因可能是由于長時間的酶解使一部分已解離的原生質受到損傷進而解體的緣故。

2.4PEG濃度對原生質體轉化的影響 PEG4000（聚乙二醇4000）分子能改變各類細胞的生物膜結構，使2細胞接觸點處質膜的脂類分子發生疏散和重組，原生質體體表面的負電荷在鈣離子的連接下，形成靜電鍵，降低細胞表面的極性，促使之間粘著和結合，在高pH、高鈣離子的作用下，鈣離子和結合在質膜上的PEG被洗脫，導致電荷平衡失調并重新分配，使2種原生質體形成具有共同質膜的融合體。由表4可知，試驗選用PEG4000對擬南芥葉肉原生質休進行轉化，結果發現在PEG4000濃度發生變化時，轉化效率也隨之發生變化。PEG濃度為20%時，擬南芥轉化效率僅有9%，隨著PEG濃度的升高轉化效率也隨之升高；當PEG濃度為40%時，轉化效率達到67%（圖1A）。玉米中在PEG濃度20%時轉化效率有17%，在30%和35%時轉化效率達到了45%左右（圖1B），且細胞碎片較少，PEG濃度在增加雖增加了轉化效率，但是細胞碎片開始增多。PEG的濃度越高，其對細胞的影響也越來越大，因為PEG對細胞有一定的毒害作用，高濃度下常致使細胞發生破碎。另外，PEG的物理化學性質決定了其在較高濃度下（大于或等于50%）很難溶解，所以在較高濃度下不便于試驗操作。所以在轉化擬南芥和玉米原生質體時，試驗選擇了40%和30%的溶液，以達到最好的效果。在培養16 h后用激光共聚焦顯微鏡觀察，發現擬南芥轉化效率（67%）比玉米轉化效率（45%）高，細胞碎片比玉米少。

3結論與討論

酶解去壁對植物細胞是一個嚴重的機械損傷和生理損傷過程[11]。原生質體適宜的分離條件要求既能將細胞壁完全去除，又要盡量減少對原生質體的損傷。采用酶解法來游離煙草葉肉原生質體時，試驗發現酶液的濃度、酶液的處理時間及其滲透壓等對原生質體的產量及轉化活力等都有很大的影響。日本生產的纖維素酶（ Cellulase R10）和離析酶（M acerozyme R10）效果最佳，酶濃度經過組合分析，發現擬南芥在1.5% Cellulase R10，0.5% Mecerozyme R10時裂解比較完全并且細胞碎片比較少，玉米在1.5% Cellulase R10，0.5% Mecerozyme R10時裂解也比較完全。在據以往的報道，滲透壓穩定劑一般是用甘露醇、山梨醇、蔗糖或葡萄糖等，試驗過程中用甘露醇滲透壓穩定劑， 結果是在擬南芥當甘露醇濃度為0.40 mol/L時原生質體游離效果最為理想，玉米以濃度為0.45～0.50 mol/L的甘露醇做酶液的滲透壓穩定劑時效果最理想。酶解處理一般靜置在黑暗中進行，擬南芥和玉米在未去表皮情況下酶解時間分別以4和6 h最佳，如果超過時間，原生質體的轉化活力就會明顯降低，細胞碎片增多。

在質粒轉化過程，PEG濃度對轉化效率和轉化后的原生質體狀態有很大的影響，擬南芥在40%或者45%濃度下可以獲得較高的轉化效率，玉米在30%可以獲得較高的轉化效率和保持穩定的原生質體。玉米原生質體比擬南芥原生質體容易皺縮破裂，玉米一般在16 h后就開始破裂，而擬南芥在4 ℃卻可以保持48 h以上還可以看到GFP。還有材料狀態、質粒純度和培養過程，都會對轉化效率有很大影響。尤其是在雙質粒轉化過程，需要較高的轉化效率，最后是用氯化銫超速離心法提取超純質粒。酶解后的原生質體失去了細胞壁的保護，極易受滲透壓變化的影響而導致破裂，因此在制備原生質體的過程中，要保證酶解液等所用溶液的滲透壓盡量接近在玉米葉肉細胞自身的滲透勢，避免細胞吸水脹破或者失水皺縮；所有的操作過程都要輕柔，尤其是用移液槍吸取和離心速度要控制好，以防止因劇烈震蕩而導致原生質體破裂；在原生質體轉化過程中，PEGCa2+濃度（玉米30%和擬南芥40%）、質粒DNA純度，PEG誘導轉化時間等是影響轉化效率的關鍵因素。

參考文獻

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[2] SAXENA P K，GILL R.Plant regeneration from mesophyll protoplasts of the tree legume Pithecellobium dulce benth[J].Plant Sci，1987，53：257-262.

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