1株產膽紅素氧化酶新菌株的分離與鑒定研究

黃世臣　趙敏

摘要[目的]分離與鑒定1株產膽紅素氧化酶的新菌株。[方法]利用常規的微生物分離培養技術，從玉米葉片的病斑中分離出一株產膽紅素氧化酶（bilirubin oxidase，BOD）的絲狀真菌。[結果]通過形態學、生理學和rDNAITS（登錄號為JN251106）序列分析，該菌株被鑒定為Bipolaris australiensis，命名為B.australiensis HD1，屬子囊菌門格孢腔菌目格孢腔菌科平臍蠕孢屬澳大利亞平臍蠕孢霉（B.australiensis），亦稱澳洲雙孢霉，是1株沒有被報道過的具有產BOD的新產生菌；在不含任何誘導劑的發酵液中28 ℃，150 r/min，培養6 d，其酶活可達為1 000 U/L。[結論]該方法成功分離出1株產膽紅素氧化酶的新菌株，為BOD的產生菌提供了新的微生物來源。

關鍵詞膽紅素氧化酶；Bipolaris australiensis；分離鑒定

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）12-03486-05

基金項目中國國家林業廳984項目（2012-4-03）；自然科學基金（31170553，30671702，30170775）。

作者簡介黃世臣（1973- ），男，吉林東遼人，副教授，從事環境微生物學的教學與研究。*通訊作者，從事環境微生物學的教學與研究。

膽紅素氧化酶（EC 1.3.3.5）因其能催化膽紅素氧化而得名，是由日本學者最早從絲狀真菌（Myrothecium verrucaria）中分離并純化出來[1]。現代研究表明，該酶屬多銅氧化酶家族中一個成員。到目前為止，被文獻報道的該酶微生物來源不足10種[2]，而被商業化生產的只有2種，分別為Myrothecium verrucarria和Trachyderma tsunodae。因該酶在醫療衛生[3-6]和生物燃料電池[7-11]領域具有巨大的應用潛力。從近5年來的文獻數量上變化情況看，該酶現已逐漸成為多銅氧化酶家族中研究的熱點。膽紅素氧化酶與漆酶同屬多銅氧化酶家簇成員，而漆酶遠比膽紅素氧化酶的物種報道的多（漆酶目前已被鑒定的有220種），但膽紅素氧化酶具有漆酶無法比擬的特性，如在生理條件下穩定、對Cl-的高耐受性、高熱穩定性、可專一氧化膽紅素等可在生物燃料電池及醫學臨床診斷上被廣為利用。基于此，筆者從環境中對產生該酶的微生物進行大量的篩選和鑒定研究，現報道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。土壤樣品，采自黑龍江省伊春市涼水國家級自然保護區的針葉闊葉混交林，吉林省長白山國家級自然保護區的針葉闊葉混交林，吉林省龍井市水稻田土壤；植物病害葉片樣本由吉林農業大學農學院植物保護教研室白慶榮博士饋贈。

1.1.2主要儀器。UV2800紫外可見分光亮度計，購自尤尼柯（上海）儀器有限公司；Nikon ECLIPSE TE 2000E尼康倒置顯微鏡，購自日本尼康公司；Eppendorf centrifuge 5418離心機，購自Germany；純水儀，購自MilliPore公司。

1.1.3主要試劑。膽紅素結晶，購自Adamasbeta（Switzerland），吸光系數1 038 g/L（產家提供）；DNA凝膠回收試劑盒，購自北京莊盟公司；pMD18T載體，購自大連寶生物工程有限公司；其他試劑均為國產分析純或更高級純品。

1.2方法

1.2.1溶液的配制。①培養基的制備。培養基配方見文獻[12]，真菌分離培養基為查氏培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）、馬丁氏培養基；細菌分離培養基為牛肉膏蛋白胨培養基；真菌富集培養基為PDA；細菌富集培養基酵母提取物蛋白胨氯化鈉瓊脂培養基。真菌總DNA提取培養基為改良Mandels培養基[13]。②酶活測定緩沖液的配制。15 mmol/L TrisHCl pH 8.1，含1.0 mmol/L EDTANa2·2H2O，稱取Tris base 1.815 g 溶于1 000 ml蒸餾水中，在37 ℃水浴中用濃鹽酸調pH至7.4～7.6，加入0.336 g EATANa2·2H2O，充分溶解后備用。③膽紅素溶液的配制。稱取膽紅素結晶2.0 mg，放入1.5 ml EP管中，加入0.5 ml無水甲醇，用槍吸打混勻，再逐滴加入預冷的0.2 mol/L無水碳酸鈉溶液0.5 ml，用槍吸打混勻，置-20 ℃下備用5 d內使用。

1.2.2引物。①rDNAITS序列通用引物。ITS1：5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′；ITS4：5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′。②菌落PCR鑒定陽性轉化子引物。M13：5′CGCCAGG GTTTTCCCAGTCAACGAC3′；RVM：5′GAGCGGATAACAATTTCACACAGG3′。以上所有引物均由大連寶生物工程有限公司合成。

1.2.3菌株的發酵培養及酶活檢測。將來源于不同分離培養基中的培養物，依據外在性狀的差異及時用接種鉤或接種環以稀釋涂布、單孢分離、平板劃線等方法將其轉移至另一裝有相同培養基質的無菌平板中進行繼代培養，經多次轉接，獲得其純培養并編號，然后，通過富集培養獲得大量的接種物，將分離富集的菌株分別恒溫振蕩培養。將培養后的菌懸液用離心的方法去除菌體，吸取上清作為粗酶液用于檢測其是否產膽紅素氧化酶。

每個三角瓶（250 ml）中加入培養基100 ml，121 ℃高壓濕熱滅菌20 min，待培養基冷卻至室溫后，接入適量的新鮮富集培養物，真菌以每個三角瓶中加入一塊固態平板培養的接種物（菌落直徑1 cm）；細菌以平板培養24 h的菌體用滅菌水5 ml稀釋混均后吸取100 μl接種于三角瓶中發酵培養。真菌放于28 ℃的恒溫振蕩搖床120 r/min搖動6 d后檢測酶活；細菌置于37 ℃的恒溫振蕩搖床120 r/min搖動2 d后檢測酶活。

1.2.4膽紅素吸收波長測定。取適量的膽紅素晶體用1∶1（V/V）的甲醇和NaCO3（0.2 mol/L）溶液溶解后取20 μl與2.95 ml酶活測定緩沖液混均，吸入石英比色皿內，用酶活測定緩沖液調零后，在UV2102C/PC/PCS型分光亮度計上進行全波長掃描，掃描波長靈敏度設為1 nm。

1.2.5膽紅素氧化酶的酶活定性及定量檢測。①酶活定性檢測。用移槍吸取2.5 ml緩沖液于小玻璃試管中，并將其置于37 ℃水浴中10 min預熱；吸取經發酵培養液離心后所得上清0.5 ml放入小試管中，預熱5 min后，加入膽紅素溶液20 μl（2 mg/ml），觀察溶液的顏色是否變綠，變綠者為產生膽紅素氧化酶的菌株。②酶活定量檢測。在37 ℃條件下，氧化1 μmol膽紅素所需要的酶量定義為一個酶活。

1.2.6形態學鑒定。①菌落形態顯微鑒定。將產生膽紅素氧化酶的菌株接種于PDA平板上，倒置于28 ℃恒溫培養箱內培養7 d后觀察菌落形態。②菌絲形態顯微鑒定。挑取在PDA培養基上培養4 d后的新生菌絲體少許，置于含有浮酚油的載玻片上，用解剖針小心將菌絲分開，在倒置顯微鏡下觀察菌絲的顏色、隔膜有無等。③分生孢子和分生孢子梗顯微形態鑒定。將菌株接種于水洋菜-麥桿培養基中，于20 ℃、360 nm近紫外燈照射，12 h光照、12 h黑暗交替培養。每24 h鏡檢觀察一次菌落大小、顏色，分生孢子的大小、數量、隔膜產生等。

安徽農業科學2014年1.2.7生理學鑒定。①分生孢子隔膜形成次序。將目標菌株在PDA培養基上培養5～7 d后，剝去菌落的表面氣生菌絲，用挑針挑取帶有培養基直徑為1 cm的菌塊放于培養皿中的濾紙上（含有內含3～5層濾紙，事先用滅菌水將其濕透），置于20 ℃下放置6 d后鏡檢，以后每隔1～2 h觀察1次。②分生孢子萌發方式。取一潔凈的載玻片，將濾紙片剪成與其大小相近的紙片，同時在濾紙片的中央處剪一邊長約為0.5 cm的正方形小孔，用水濕潤濾紙后將其附著于載玻片上，然后將此載玻片放入培養皿內，培養皿內事先放置3層濾紙并用滅菌水浸潤，用報紙將培養皿包好后高壓滅菌。待培養皿溫度降至室溫后，取培養5 d的PDA平板用接種鉤挑取一定量的菌體（含有菌絲和分生孢子）均勻得涂布在正方形濾紙周圍，置于28 ℃上恒溫培養，每隔24 h鏡檢一次。③分生孢子在分生孢子梗上的產孢方式。處理方法同“②”，保濕培養2～4 d后鏡檢。④最適生長溫度。菌株在PDA平板上培養5 d，在無菌條件下，用滅菌的打孔器（直徑0.5 cm）將菌落切割為大小一致接種體，將其接種于PDA平板中央，每一平板接種一塊接種體，28 ℃恒溫條件下倒置培養24 h后，將平板分別置于5、25、28、30、35和40 ℃恒溫條件下倒置培養3 d測量菌菌直徑；每處理3次平行。⑤最適生長pH值。配PDA培養基，在加入瓊脂前等待培養基溫度降至室溫后調pH值，pH設置為4、5、6、7、8、9和10，分別加入瓊脂后高壓滅菌。接種后，28 ℃恒溫倒置培養108 h后測量菌落直徑；每處理3次平行。

1.2.8分子鑒定——rDNAITS序列分析。①真菌基因組DNA提取。用改進的CTAB法提取真菌染色體DNA[12]。②ITS序列擴增。真菌ITS序列通用引物[13]為ITS1和ITS4；PCR反應體系及反應程序見表1和表2，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。③目的片段的純化。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外燈下切取含有目的片段的膠塊轉移至1.5 ml EP管中，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。④目的片段的克隆與轉化。取純化的PCR產物2 μl，按說明書上的方法與pMD18T載體連接3 h后，將連接物轉化至高效感受態E.coli JM109細菌細胞中，并將其置于LB液體培養基37 ℃、200 r/min振蕩培養1 h，取100 μl轉化菌液，均勻地涂在含Xgal、IPTG和Amp的LB平板上，并設不含Amp的LB平板作對照，37 ℃培養12～16 h。⑤重組子篩選與鑒定。隨機挑取7個白斑菌落分別接種于1.0 ml LB培養基中，200 r/min，培養4 h，取2 μl作為菌落PCR的模板；PCR反應體系及反應程序見表3和表4；取4 μl進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。⑥rDNAITS序列測定與分析。將確定為陽性克隆的菌液送上海生物工程公司進行測序。在測序結果中找到目的序列在NCBI數據庫中進行同源性比對，下載相關序列，采用Mega5.1軟件對序列進行親緣性及系統發育分析。

2結果與分析

2.1膽紅素的最大吸收波長測定圖1表明，膽紅素在440 nm處有最大吸收峰，因此試驗中膽紅素氧化酶的酶活測定波長選定在440 nm處。

2.2形態學鑒定通過對不同來源的土壤樣品和植物葉片

鄰接法建樹程序建系統發育樹（圖10）。對比結果顯示，HD1菌株與Bipolaris sp.，Cochliobolus geniculatus，Pleosporaceaesp.，Dothideomycete sp.，Bipolaris papendorfii和Pleosporaceae sp.6株菌物有100%的同源性，但序列間的自展支持率卻不高（低于65%）。鄰接樹中的Cochliobolus geniculatus為cynodontis的同種異名。Cochliobolus屬為Bipolaris屬的有性型，在試驗中未發現其有性型。系統發育樹的結果表明，研究所提交的序列在NCBI庫中的比對結果只能提供種屬鑒定的部分分類鑒定信息，最終的種屬鑒定有必要結合形態學和生理學方面的數據支持。

結合形態學，生理學和rDNAITS序列分析結果及文獻信息[14]，菌株HD1被鑒定為Bipolaris australiensis。注：標“*”為研究提交序列；括號內字母及數字為基因登錄號；標尺代表序列間差異為0.5%；節點處數字為自展值。

圖10鄰接法建菌株HD1系統發育樹3結論

試驗從患病玉米葉片中分離出1株產膽紅素氧化酶的真菌菌株，通過形態學、生理學和rDNAITS序列分析，該菌株被鑒定為Bipolaris australiensis，命名為B.australiensis HD1，屬子囊菌門格孢腔菌目格孢腔菌科（Pleosporaceae）平臍蠕孢屬（Bipolaris）澳大利亞平臍蠕孢霉（Bipolaris australiensis），亦稱澳洲雙孢霉，是一株沒有被報道過的具有膽紅素氧化酶酶活性的新菌株，該菌物在無誘導劑存在下，28 ℃、150 r/min恒溫搖床培養6 d后，酶活可達1 000 U/L，為膽紅素氧化酶的產生菌提供了新的微生物來源。

參考文獻

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