roGFP1探針在玉米幼胚中響應細胞氧化還原狀態改變的初步研究

吳佳梅　劉曉寧　趙軍

摘要[目的]建立roGFP1探針響應玉米體內氧化還原狀態變化的穩定表達系統。[方法]首先利用基因槍介導玉米幼胚轉化法瞬時表達roGFP1基因，利用激光共聚焦顯微鏡405和488 nm激發光通道對10 mmol/L H2O2和2 mmol/L DTT溶液處理下的幼胚進行510 nm的GFP熒光成像，后通過ImageJ處理圖像和分析熒光比值[405/488 nm]；同時利用農桿菌介導玉米幼胚轉化法開展roGFP1基因的玉米穩定轉化，進行Southern Blot鑒定和熒光顯微鏡觀察。[結果]在玉米幼胚瞬時表達系統中，經10 mmol/L H2O2處理后，roGFP1探針的熒光強度比值[405/488 nm]由原來的0.844升高至1.837，而在2 mmol/L DTT溶液處理下的熒光強度比值下降至0.911；經Southern Blot鑒定和GFP熒光檢測獲得了roGFP1轉基因陽性植株。[結論]在玉米幼胚瞬時表達系統中，roGFP1探針能夠響應由外源氧化還原劑引起的體內氧化還原狀態改變；獲得了表達roGFP1的轉基因玉米植株。

關鍵詞roGFP1；熒光強度比值；玉米；瞬時表達；穩定轉化

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）12-03491-03

作者簡介吳佳梅（1990- ），女，江蘇常州人，碩士研究生，研究方向：植物抗逆分子生物學。

玉米是我國重要的糧食作物和飼料來源，自然條件下，干旱、低溫、高鹽等非生物逆境制約了玉米的生長發育和產量。活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）在植物遭受非生物逆境時大量積累[1]，曾一度被認為是有氧代謝過程中具有毒性的副產物。然而近年來的研究發現，活性氧作為不可或缺的成分參與調控植物的生長發育以及各種脅迫反應，是細胞信號轉導網絡過程中一種重要的信號分子[1]。ROS的作用機制成為當今的研究熱點，利用植物的ROS信號轉導網絡在提高擬南芥、紫花苜蓿、小麥和水稻等的抗逆性研究上取得了較大進展[2，13-14]，而測定植物體內ROS含量的動態變化對于研究植物ROS信號轉導網絡具有重要意義。以往通常使用單態氧（Singlet Oxygen Sensor Green，SOSG）探針，超氧化物陰離子（Dihydroethidium，DHE）探針，二氫羅丹明（Dihydrorhodamine 123，DHR）染料，Amplex Red試劑，OxyBurst green試劑和Dihydrodichlorofluorescein（H2DCF）等熒光探針來測定植物體內ROS含量[3]，但是這些方法都存在著諸多不足。一方面，由于不可逆性，無法得知植物體內ROS含量的動態變化；另一方面，探針自身也存在潛在的問題，比如當OxyBurst green接觸到氧氣時就會被氧化[4]。Hanson[5]等對野生型綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）進行改造后得到氧化還原敏感的roGFP1 biosensor （C48S，S147C和Q204C），在氧化環境下，roGFP1的147位和204位的半胱氨酸殘基形成二硫鍵[6]，由于生色團的中性電子和陰離子之間的內在平衡，roGFP1探針在400 nm和475～490 nm的激發光下的熒光強度比值發生改變，這種熒光強度比值法僅受激發光的影響，從而消除了由探針濃度、光漂白以及組織厚度等引起的誤差[5]。roGFP探針在哺乳動物細胞中能夠響應氧化還原狀態改變[5，7]得到證實后，被廣泛應用于擬南芥[8-9]、煙草葉肉細胞[10]、酵母[11]和小鼠表皮細胞[12]中。

前人對roGFP探針的研究主要集中在哺乳動物細胞和擬南芥等模式植物細胞中，在作物細胞中的研究鮮有報道。探究roGFP 探針能否響應玉米體內的氧還改變對于進一步研究玉米ROS信號轉導網絡、提高玉米抗逆性具有重要意義。筆者利用玉米幼胚瞬時表達系統檢測roGFP1探針的熒光強度比值[405/488 nm]是否響應動態的氧化還原環境，然后利用農桿菌介導玉米幼胚轉化法創制轉基因陽性植株，旨在為規模化鑒定ROS信號轉導基因提供直觀便捷的檢測工具。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。雜交種Hi II和自交系綜31玉米幼胚。

1.1.2供試菌株以及載體。大腸桿菌DH5α和農桿菌C58C1由實驗室保存；含有9zf（-）PubiTnos載體的DH5α大腸桿菌菌株由實驗室保存；pCAMBIA1304P35SroGFP1 Tnos載體，由Keni Jiang惠贈。

1.1.3主要儀器。PTC0200型PCR儀和PDS1000/He臺式基因槍，購自BioRad公司；LSM 700激光共聚焦顯微鏡和HAL 100熒光顯微鏡，購自ZEISS公司。

1.1.4主要試劑。限制性內切酶，購自New England Biolabs（NEB）公司；Taq DNA聚合酶和dNTP等試劑，均購自寶生物工程（大連）有限公司；引物合成及測序，由生工生物工程（上海）有限公司完成；纖維素酶和離析酶，均購自日本Yakult Pharmaceutical公司；甘露醇、PEG以及一些常用試劑，均購自Amresco公司。

1.2方法

1.2.1roGFP1基因表達載體的構建。按照圖1的方法構建roGFP1基因表達載體9zf（-）PubiroGFP1Tnos和pCAMBIA1304PubiroGFP1Tnos；用NcoI和Afl II雙酶切pCAMBIA1304P35sroGFP1Tnos質粒獲得roGFP1片段，同時用EcoR V酶切9zf（-）PubiTnos獲得大片段，roGFP1roGFP1片段經Klenow聚合酶補平后和9zf（-）PubiTnos回收片段經酶連后獲得9zf（-）PubiroGFP1Tnos載體，轉化大腸桿菌DH5α，經酶切鑒定和測序，于-80 ℃保存陽性克隆。9zf（-）PubiroGFP1Tnos質粒經Bam HI和Afl II酶切后獲得ubiroGFP1片段，用Bam HI和Afl II酶切pCAMBIA1304P35s roGFP1Tnos后獲得大片段，將ubiroGFP1和pCAMBIA1304P35sroGFP1Tnos回收片段酶連后獲得pCAMBIA1304 PubiroGFP1Tnos，轉化農桿菌C58C1，經酶切鑒定和測序后，于-80 ℃保存陽性克隆。

圖1roGFP1基因的玉米表達載體構建流程1.2.2玉米幼胚瞬時表達系統的建立。以Hi II雜交系授粉后20 d的玉米幼穗為材料，經過5% NaClO處理后剝幼胚，將幼胚用MS清洗2次后轉移至固體高滲培養基中；用10 μl金粉包裹1 μg質粒制成微彈；轟擊幼胚過程按照基因槍說明書進行，氣壓為7.586 MPa，完成后放置植物培養箱內過夜培養。

1.2.3激光共聚焦顯微鏡觀察。將基因槍轉化后培養過的幼胚制成橫切片置于載玻片上蓋上蓋玻片后利用ZEISS LSM700，選取405和488 nm 2個通道進行roGFP1觀察和拍攝，隨后加入10 mmol/L H2O2處理5～10 min并拍攝圖像，完畢后吸去H2O2溶液，加入2 mmol/L DTT溶液處理5～10 min再次拍攝圖像。

1.2.4農桿菌介導轉化玉米幼胚。用pCAMBIA1304PubiroGFP1Tnos載體轉化C58C1農桿菌獲得轉化菌株；用該轉化菌株菌液浸染綜31野生型玉米幼胚，經過共培養后，轉入到含潮霉素B（Hygromycin B）的選擇培養基上進行篩選，將誘導分化的玉米幼苗移栽至大棚繼續培養。

1.2.5PCR 和Southern Blot鑒定轉基因植株。PCR鑒定所用引物為FWhyg和RV35S（表1），條件為變性溫度95 ℃，45 s，退火溫度60 ℃，40 s，延伸溫度72 ℃，1 min，30個循環，陽性植株PCR產物應出現大小為542 bp，然后熒光觀察玉米葉片。結合兩者的初步鑒定，將篩選出的玉米材料做Southern Blot鑒定，大致過程如下：利用roGFPF和roGFPR（表1）擴增出roGFP1基因特異的探針；用CTAB法大量提取玉米基因組DNA，Hind III 酶切40 V電泳過夜后將凝膠進行酸堿變性，利用毛細管堿性轉移法轉膜18 h，將膜80 ℃烤箱烘烤2 h后進行預雜交，2 h后用同位素標記的roGFP1探針進行雜交試驗，18 h后洗膜和壓片。

1.2.6統計分析。利用ImageJ軟件對圖片進行處理，熒光強度比值計算過程如前所述[8]。

2結果與分析

2.1RoGFP1探針響應H2O2和DTT引起的玉米幼胚氧化還原狀態改變為了探究roGFP1探針是否響應玉米體內氧化還原狀態的改變，試驗利用基因槍介導轉化法在玉米幼胚中瞬時表達roGFP1基因，通過激光共聚焦顯微鏡觀察不同氧化還原處理下幼胚中的405和488 nm熒光強度并計算比值。結果發現，roGFP1基因能在玉米幼胚中成功表達；向幼胚切片中先后加入10 mmol/L H2O2溶液roGFP1探針迅速被氧化，熒光強度比值從0.844升高至1.837，而再加入2 mmol、L DTT溶液后roGFP1探針又被還原，熒光強度比值下降至0.911（圖2）。這表明roGFP1基因能夠在玉米幼胚中成功表達，并且對幼胚細胞內的可逆性氧化還原狀態改變作出響應。

注：（A）為未處理的玉米幼胚；比值的顏色代表roGFP1的氧化還原狀態，藍色表示roGFP1的完全還原狀態，黃色表示roGFP1的完全氧化狀態；（B）為經10 mmol/LH2O2溶液處理的幼胚；（C）為經2 mmol/LDTT溶液處理的幼胚；Scale bar=300 pixel。

roGFP探針在眾多植物細胞中的研究備受關注，然而在玉米中還缺乏研究。試驗首先通過在Hi II植株授粉后20 d的玉米幼胚中瞬時表達roGFP1基因試驗證實，roGFP1能夠在玉米中響應H2O2和DTT引起的可逆性氧化還原狀態改變，這與Meyer[8]利用roGFP2探針在擬南芥根中的研究結果相吻合。試驗隨后利用農桿菌浸染綜31玉米幼胚，誘導分化的玉米幼苗經熒光顯微鏡觀察和Southern Blot鑒定后存在陽性植株，表明roGFP1基因已經整合到玉米基因組中。