毛霉型豆豉中總DNA提取的比較研究

鐘燕　騫宇　李希宇　陳煉紅　索化夷

摘要[目的]對毛霉型豆豉中總DNA的提取方法進行比較。[方法]選用常用的3種DNA提取方法（溶菌酶法、蛋白酶KCTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法和改良溶菌酶法）提取發酵豆豉中的總DNA，并測定總DNA的純度，比較3種方法的優劣。[結果]通過瓊脂糖凝膠電泳對提取效果進行觀察比較發現，蛋白酶KCTAB法提取豆豉中微生物的宏基因組DNA的純度最好，質量最高。[結論]蛋白酶KCTAB法更適合豆豉這類發酵食品宏基因組DNA粗提取，可以作為豆豉宏基因組學研究的基礎。

關鍵詞DNA提取；豆豉；微生物；PCR

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）12-03499-03

基金項目國家自然科學基金青年科學基金項目（31201411）；西南大學博士基金項目（SWU112057）。

作者簡介鐘燕（1994- ），女，湖南郴州人，本科，專業：食品質量與安全。*通訊作者，副教授，博士，從事食品科學研究。

豆豉是我國漢族傳統發酵豆制品，因其醇香濃郁，富于酯香，成品油潤化渣，深受人們喜愛。在我國，豆豉除了供食用外，還有治療疾病的效果，歷代醫書都有豆豉治療疾病的記載，李時珍的《本草綱目》中則有“豆豉具開胃增食、消食化滯、發汗解表、除煩喘等療效”的記載[1]。現代科學表明，豆豉還有很高的營養價值，含有豐富的蛋白質、糖，以及VB1，VB2和VE等[2]，同時含有多種功能成分，具有抗癌、溶解血栓、降血壓、抗氧化和抗菌等生理功能[3]。

但是，毛霉型豆豉的生產采用傳統自然發酵工藝，產品很難形成穩定的質量[4]。另外，傳統發酵豆豉中的微生物區系復雜，大部分發酵豆豉中微生物起作用的機理仍需揭示[5]。對于豆豉微生物區系的研究是闡明豆豉成熟機制的重要組成部分，而現在主要采用非培養技術的方式進行研究[6-7]，豆豉DNA的高質量提取是這項技術研究的前提基礎。

永川毛霉型豆豉是我國傳統食品，因其健康美味、營養豐富深受廣大消費者喜愛。但豆豉形成過程中的微生物作用機理研究較少，豆豉形成品質不穩定。傳統發酵豆豉的微生物區系復雜，大多選擇非培養技術進行研究，而提取高質量的DNA是非培養技術的前提條件。筆者通過對豆豉發酵的3種DNA提取方法的比較研究，尋求一種適合發酵食品穩定可靠的DNA提取方法，以期為豆豉微生物后續研究提供參考和依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。處于不同發酵階段的永川毛霉型豆豉，為永川豆豉食品有限公司經天然制曲發酵，原料大豆產地為吉林省。

1.1.2主要儀器。MiniPROTEAN Tetro Cell核酸電泳系統，購自BioRAD公司；G：Box EF凝膠成像系統，購自Syngene公司；XW20A多功能食品加工機，購自鑫威電器有限公司；AIR TECH超凈工作臺，購自蘇凈安泰公司；LDZX40BI立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，購自上海申安醫療器械廠；LX100手掌型離心機，購自江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；GL88B渦旋混合器，購自江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；UV755B可見紫外分光光度計，購自上海分析儀器總廠；ZHWY211B恒溫培養振蕩器，購自上海智誠分析儀器有限公司；EDC810雙槽PCR儀，購自東勝創新生物科技有限公司。

1.1.3主要試劑。氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鈉、DNA染色劑等均為分析純，均購自北京索萊寶科技有限公司；溶菌酶、蛋白酶K、Marker、SDS、PEG、CTAB和TrisHcl，均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2方法

1.2.1永川豆豉生產工藝流程。大豆篩選→浸泡→瀝干→常壓蒸料→冷卻→自然發酵制曲→翻曲→拌和（食鹽含量15%、醪糟、白酒）→入罐發酵后熟→成品。

1.2.2溶菌酶法粗提取DNA[8-9]。參照熊開容從活性污泥中提取DNA的方法，改進后使用[10]。取豆豉樣品5.000 g，在無菌條件下轉移到15 ml的PBS（pH約7.0）中，攪拌后用4層紗布過濾，于30 ℃、120 r/min稀釋振蕩15 min，得到的溶液以2 000～3 000 r/min離心5 min，收集到的上清液再以14 000 r/min，4 ℃離心10 min；棄去上清液，用等體積的TES溶液洗滌1次，以14 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄去上清液。

沉淀加入1.5 ml溶菌酶溶液，混合物在37 ℃下 225 r/min振蕩1 h；加入0.5 ml裂解緩沖液，0.5 ml磷酸鹽緩沖液，0.5 ml氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）。離心管在漩渦混合器上3 000 r/min振蕩10 min，得到的裂解液以6 000 r/min離心3 min，上清液轉入另一離心管。向原管加入0.5 ml去離子水重新離心10 s，2 次離心的上清混合，9 000 r/min離心5 min，收集水相。水相加入0.6倍體積異丙醇沉淀1 h，12 000 r/min離心10 min；得到的沉淀以70%冰預冷的乙醇重復洗滌后風干，溶于500 ml TE緩沖液。取100 μl作DNA濃度測定或其他分析，其余的貯存于-20 ℃。

1.2.3蛋白酶KCTAB法粗提取DNA。取豆豉樣品5.000 g，在無菌條件下轉移到15 ml的PBS（ph 7.0）中，攪拌后用4層紗布過濾，30 ℃、120 r/min稀釋振蕩15 min。得到的溶液以2 000～3 000 r/min離心5 min，收集到的上清液再以14 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄去上清液，用等體積的TES溶液洗滌1次，以14 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄去上清液。

主要參照Zhou[11]的方法進行試驗，沉淀加入1.0 ml DNA提取液混合，然后加入20 μl 10 mmol/L的Protein K，37 ℃水浴并振蕩30 min，再加入150 μl SDS（20%），65 ℃水浴2 h，每20 min倒置1次；11 000 r/min 4 ℃離心分離5 min；將上清液轉移到新的5 ml離心管，沉淀再加入0.5 ml提取液和50 μl 10%SDS；渦旋振蕩后于65 ℃水浴10 min，11 000 r/min 4 ℃離心5 min，收集上清液合并于上次上清液。重復上述操作，3 次上清合并。上清液中加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1，V/V），顛倒混合；室溫6 000 r/min離心5 min，吸取上清液轉移至新的5 ml離心管中；水相加入0.6倍體積異丙醇沉淀1 h，于12 000 r/min離心10 min；沉淀以70%冰預冷的乙醇重復洗滌后風干，溶于500 μl TE緩沖液。取100 μl作DNA濃度測定或其他分析，其余的貯存-20 ℃。

1.2.4改良溶菌酶法粗提取DNA。主要依據張瑞福[12]、王建玲[13]從土壤微生物中提取DNA的方法，改進后使用。取5.000 g豆豉樣品，在無菌條件下轉移到15 ml的磷酸鹽緩沖液中，振蕩2～3 min后，于5 000 r/min離心5 min，棄去上清液，重復洗滌樣品直至上清液基本清澈；再用15 ml磷酸鹽緩沖液洗滌，小心轉移洗滌液至另一離心管中；5 000 r/min再次離心5 min，棄去上清液。

取經預處理的豆豉樣品，加入0.8 ml的溶菌酶溶液，5 μl蛋白酶K，混合物在37 ℃下200 r/min振蕩1 h，然后加入經65 ℃預熱過的0.3 ml裂解緩沖液、0.3 ml磷酸鹽緩沖液和0.6 ml氯仿/異戊醇（24∶1，V/V），65 ℃水浴10 min，每隔2～3 min置漩渦振蕩儀上振蕩30 s，然后于5 000 r/min離心3 min，小心吸取上清轉入另一2 ml離心管，加入0.6倍體積異丙醇冰浴沉淀30 min，于15 000 r/min離心10 min，棄去液相；沉淀以1.0 ml 75%冷乙醇輕微振蕩洗滌，4 ℃下以13 000 r/min離心2 min，待乙醇徹底揮發后，加入500 μl TE緩沖液溶解DNA；取100 μl作DNA濃度測定或其他分析，其余的貯存-20 ℃。

1.2.5DNA的純度測定。采用紫外分光光度計直接檢測粗提取DNA的分光度，DNA的A260/A280值可以作為評價DNA純度的一個指標。

1.2.6DNA的質量測定。用50×TAE溶液配制0.7%瓊脂糖凝膠，使用Gold View核酸染料。吸取10 μl DNA溶液，加入1 μl的10×loading Buffer，混合均勻后依次加入點樣孔中，然后吸取5 μl的λDNA/HindⅢ Marker加入一端的點樣孔，在120 V恒定電壓下進行電泳，電泳時間為50 min。電泳結束后在凝膠成像系統中觀察電泳結果并拍照、分析。

2結果與分析

2.1圖像分析圖1表明，3種不同細胞裂解方法所提取的DNA在Marker條帶的附近出線4條條帶，而且提取的DNA條帶完整性并不相同。根據圖像來看，3號和4號條帶的亮度強于溶菌酶和改良溶菌酶法的1號、2號、5號和6號的條帶，其中3號模板的條帶的亮度為最強，說明該法所提取的DNA得率為最高。

注：M為λDNA/HindⅢ Marker；1～2為溶菌酶法；3～4為蛋白酶KCTAB法；5～6為改良溶菌酶法。

2.2不同方法提取的DNA濃度比較A260/A280值在1.8～1.9的范圍內說明DNA純度很高，A260/A280小于1.8說明提取的DNA中含有一些蛋白質和多酚，A260/A280大于1.9說明提取的DNA中含有一些RNA；較純凈的核酸的A260/A230值大于2.0。另外，發酵豆豉中腐殖酸會影響A260吸光度，從而影響DNA純度[14]。

由表1可知，3號和4號的A260/A280值接近1.9，A260/A230值接近2.0，說明3、4號樣品的DNA純度比較高，但有RNA污染；1號、2號的A260/A280值和A260/A230值都較低，說明1號和2號樣品的DNA純度沒有3號和4號的高，有蛋白質或多酚等的污染；5號和6號的A260/A280值和A260/A230值比1號和2號的更低，說明5號和6號對應的樣品DNA純度很低。

2.33種提取方法的比較由表2可知，在DNA的提取得率上，蛋白酶KCTAB法優于溶菌酶法和改良后的溶菌酶法。提取后的DNA樣品分裝凍存在-20 ℃條件下1周后仍可以使用，基本無降解[15]。潘立等以曲霉菌為例，在蛋白酶KCTAB法的基礎上建立了一種快速提取絲狀真菌DNA的試驗方法[18]。吳則東等通過對不同方法提取甜菜干種子的DNA進行比較研究，發現CTAB法比堿裂解法能提取出更高質量的DNA[16]。瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度計顯示，在試驗使用的3種方法中，蛋白酶KCTAB法是提取豆豉中總DNA的最理想的方法。

3結論

綜上所述，蛋白酶KCTAB法操作比較簡單，瓊脂糖凝膠電泳顯示DNA得率和DNA質量都較高。比較溶菌酶法和改良溶菌酶法，蛋白酶KCTAB法更適合豆豉這類發酵食品宏基因組DNA粗提取，可以作為豆豉宏基因組學研究的基礎。

參考文獻

[1] 張佳琪，呂遠平，譚敏.三種大豆發酵制品——豆豉納豆及天貝的比較[J].食品工業科技，2012，33（9）：441-445.

[2] 穆慧玲，李里特.豆豉的保健功能及開發價值[J].農產品加工·學刊，2008（11）：31-32.

[3] 蔣立文.發酵豆豉的研究進展[J].食品安全質量檢測學報，2013（6）：1803-1809.

[4] 柯水國，朱廣文.豆類發酵食品的研究進展[J].中小企業管理與科技（下旬刊），2013（5）：309-310.

[5] 楊福明，趙陽，侯靜，等.傳統大豆發酵食品及其工業化開發關鍵技術[J].中國調味品，2013（8）：18-21.

[6] 聶志強，韓玥，鄭宇，等.宏基因組學技術分析傳統食醋發酵過程微生物多樣性[J].食品科學，2013（15）：198-203.

[7] 張彩鳳，王婷婷，高小寬，等.宏基因組學技術及其應用概述[J].生物學教學，2013（3）：7-8.

[8] GAO P P，ZHAO L P.DNA extract ionfrom activated sludge for molecular community analysis[J].Acta Ecologica Sinica，2002，11（22）：2015-2019.

[9] 劉金英，湯斌.濃香型白酒窖泥中總DNA提取方法的研究[J].安徽工程大學學報，2013（3）：8-11.

[10] 熊開容，張智明，張敏.活性污泥DNA提取方法的研究[J].生物技術，2005，15（4）：43-45.

[11] ZHOU J Z，MARY A B，TIEDJE J M.DNA Recovery from Soils of Diversity Composition[J].Appl Environ Microbiol，1996，62（2）：316-322.

[12] 張瑞福，崔中利，曹慧，等.土壤微生物總DNA的提取和純化[J].微生物學報，2003，43（2）：276.

[13] 王建玲，趙鵬程，鄧弘毅，等.魷魚肌肉組織細菌基因組DNA提取方法的優化[J].浙江農業科學，2013（6）：737-740.

[14] CLAASSEN SHANTELLE，DU TOIT ELLOISE，KABA MAMADOU，et al.A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples[J].Journal of Microbiological Methods，2013，942：26-32.

[15] DONG B，YI J，DAI L L，et al.Evaluation of Several DNA Extraction Methods for Obtaining Total Community DNA from Anaerobic Digestion Sludge[J].Procedia Environmental Sciences，2013，18：15-18.

[16] 潘力，崔翠，王斌.一種用于 PCR 擴增的絲狀真菌DNA快速提取方法[J].微生物學報，2010，37（3）：450-453.