1種適用于轉基因玉米PCR檢測的DNA快速提取方法

戴軍　汪海　朱莉　黃大昉　郎志宏

摘要[目的]建立一種快速提取玉米基因組DNA的方法。[方法]對改良CTAB法進行進一步簡化，不需要進行沉淀、洗滌、溶解和RNA消化等步驟，建立一種快速提取玉米基因組DNA的方法。[結果]該方法獲得的DNA完整性及PCR擴增效果與試劑盒提取方法相比無明顯差異；經過對樣品ELISA檢驗可知，該方法得到的DNA用于PCR檢測結果準確。[結論]該方法能夠滿足轉基因玉米PCR檢測中快速、高效、準確、高通量的要求。

關鍵詞轉基因玉米；基因組DNA；快速提取；PCR檢測

中圖分類號S513文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）12-03494-03

基金項目轉基因生物新品種培育重大專項（批準號：2013ZX08003-001）；國家自然科學基金（批準號：30970231）。

作者簡介戴軍（1986-），男，湖北十堰人，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學與基因工程。*通訊作者，研究員，從事植物基因工程研究。

玉米作為我國重要的糧食作物和工業原料，近年來需求不斷上升，我國已從玉米凈出口國轉變成凈進口國，玉米自給率不斷下降[1]，糧食安全問題引起國人的注意。植物基因工程技術快速發展，為培育優質、高產、抗逆的玉米新品種，滿足我國對玉米的需求，保證國家糧食安全提供了新方法[2]。在轉基因玉米研究和培育過程中，陽性植株的篩選、插入序列分析、安全檢測一般都離不開分子檢測，最常用的分子檢測手段是PCR檢測。PCR檢測的基礎是提取滿足檢測需要的基因組DNA。目前，高質量的基因組DNA提取方法主要有CTAB法、SDS法、離心柱提取試劑盒法和磁珠提取試劑盒法[3-6]。但是前2種方法費時費力，后2種方法費用較高[7]，都難以適用于轉基因植株檢測時大批量提取基因組DNA的要求。在研究或者篩選群體較大（如轉基因植株的大批量篩選、遺傳規律分析等）時，提取基因組DNA就會成為一項繁重的工作，并成為檢測和篩選速度的一個重要制約因素。因此出現了堿裂解法[8]和高溫水煮法[9]等一步法提取DNA的方法。這些簡易方法成本低、速度快，但是存在DNA提取質量差、PCR效果不理想和保存時間短等問題。

筆者通過對改良CTAB法進一步簡化，摸索出經過2步處理得到用于PCR檢測的基因組DNA提取方法（簡稱“2步CTAB法”）；同時比較了離心柱試劑盒提取法和2步CTAB法在DNA提取質量、耗費時間、成本和PCR擴增效果上的差異，并對PCR檢測結果進行驗證，以期為大批量檢測PCR提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象。材料為實驗室獲得的轉Bt cry1Ah基因抗蟲材料A1和A2事件及非轉基因玉米自交系綜31。

1.1.2主要試劑。CTAB提取液（ CTAB 4 g，NaCl 16.364 g，1 mol/L TrisHCl 20 ml（ pH8.0），0.5 mol/L EDTA 8 ml，先用70 ml ddH2O溶解，再定容至200 ml滅菌）、氯仿/異戊醇（24∶1）、2×Taq mix和植物基因組DNA提取試劑盒，均購自北京康為世紀生物科技有限公司；ELISA試劑盒，購自EnviroLogix公司。

1.2方法

1.2.12步CTAB法提取玉米基因組DNA。①取50～100 mg的玉米葉片，放入1.5 ml EP管中。將EP管放入液氮中，等取完所有的樣品后，用在液氮中快速冷凍過的玻璃棒將葉片研磨成粉末（大批量操作時可以在EP管中放入珠子，在自動磨樣機上把樣品砸碎）。加入500 μl CTAB提取液，在65 ℃水浴10 min。②在水浴后的EP管中加入500 μl 氯仿/異戊醇（24∶1），振蕩混合，12 000 r/min離心5 min，取上清作為PCR模板。

1.2.2試劑盒法提取玉米基因組DNA。按照康為世紀公司《植物基因組DNA提取試劑盒使用說明書》進行操作，最后溶解在100 μl ddH2O中。

1.2.3提取的基因組DNA完整性分析。在提取的DNA中加入0.5 μl RNase（10 mg/ml），37 ℃消化30 min，取5 μl提取的DNA，加入1 μl 6×loading buffer，1%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，在凝膠成像儀上觀察、成像。

1.2.4PCR檢測效果分析。將提取的DNA稀釋10倍，取1 μl為模板，外源基因cry1Ah的特異性引物F1：CGGATGGCAAATTGGAGGAG，R1：ACTTGAGGGAATGGCACGGGT，用于擴增A1事件的cry1Ah基因片段。F2：GCATCTCCACCTACACCGACTA，R2：CGGCTGGAATCTGGGTAATC用于特異性擴增A2事件的mcry1Ah基因片段。反應體系如下：基因組DNA（ l μg/μl）0.5 μl，5′ primer（10 pmol/μl）0.25 μl，3′ primer（10 pmol/μ1）0.25 μl，2×Taq mix 10 μl，ddH2O 9 μl。擴增條件如下：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增循環數30；最后72 ℃延伸2 min。

1.2.5對PCR檢測結果的驗證。按照CTAB 2步法提取轉基因玉米A1和A2事件的基因組DNA，進行PCR檢測。同時提取樣品的總蛋白，用ELISA的方法進行對植株分離情況進行鑒定，ELISA的操作方法按照操作說明進行。

2結果與分析

2.1提取基因組DNA的完整性檢測將2步CTAB法和試劑盒法2種方法提取的基因組DNA在瓊脂糖凝膠上電泳檢測。圖1表明，這2種方法提取的DNA電泳條帶大小一致，未見有明顯的差異，也未見明顯的降解條帶，說明2步CTAB法提取的基因組DNA具有較好的完整性。

2.32種提取方法的時間和成本比較對試劑盒提取法和2步CTAB提取法的成本和提取時間進行比較，分別以少量樣品（以8個樣品為例）和大量樣品（以100個樣品為例）2種情況。由表1可知，2步CTAB法的提取成本遠低于試劑盒，提取所需要的時間也僅為試劑盒提取方法的1/4，在大批量操作時更具優勢。

3結論與討論

從1996年的170萬hm2到2013年的1.75億hm2，全球轉基因作物的種植面積增加了100多倍，這使得轉基因技術成為現代農業史上采用最為迅速的生物技術[10]。轉基因技術作為一項高新技術，受到世界各國高度重視。“轉基因生物新品種培育重大專項”的實施，也為我國發展轉基因農作物研究提供了國家戰略支撐[11]。玉米作為我國重要的糧食和工業原料，獲得一批優質、高產、抗逆的轉基因玉米是該“重大專項”的一個重要目標之一。

在轉基因玉米轉化篩選過程中，一般都需要進行大批量的PCR檢測，以確定陽性植株。對獲得的轉基因材料的后代進行遺傳規律分析時，也需要一個比較大的檢測群體進行PCR檢測。檢測的前提是提取質量可靠、可用于PCR檢測的基因組DNA，現已有的一些提取方法雖然得到的基因組DNA質量高，但提取步驟繁瑣，成本高，費時費力，尤其是不適用于大批量的群體檢測[12]。實驗室在篩選轉基因抗蟲玉米的工作中摸索出一種適用于PCR檢測的玉米基因組DNA快速提取方法，該方法在改良的CTAB法的基礎上進行進一步簡化，不需要沉淀、干燥、溶解、RNase消化等步驟，大大簡化了操作過程，節省了操作時間。同時在CTAB的配方中不需要加入巰基乙醇，大大減少對人體的危害和對環境的污染。另外，簡化操作步驟還可以減少對基因組的損傷，減小操作過程污染的可能性，減少PCR檢測過程中出現的假陽性現象。經過和試劑盒提取法比較和應用ELISA的方法進行檢驗，發現其檢測效果與試劑盒提取法無差異，準確度高，完全滿足常規的PCR檢測。實現了簡捷、快速、高效、高通量提取玉米基因組DNA的要求。

參考文獻

[1] 仇煥廣，張世煌，楊軍，等.中國玉米產業的發展趨勢，面臨的挑戰與政策建議[J].中國農業科技導報，2013，15（1）：20-24.

[2] 彭永剛，張磊，朱禎.國內外轉基因農作物研發進展[J].植物生理學報，2013，49（7）：611-614.

[3] STEWART JR C N，VIA L E.A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and other PCR applications[J].Biotechniques，1993，14（5）：748-750.

[4] EDWARDS K，JOHNSTONE C，THOMPSON C.A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis[J].Nucleic Acids Research，1991，19（6）：1349.

[5] 陳麗麗，張鵬，黃新，等.玉米基因組DNA提取及濃度測定方法評價[J].生物技術通報，2011（12）：13.

[6] 曹士亮，曹靖生，王成波，等.玉米 SSR 分子標記技術操作流程研究進展[J].中國農學通報，2012，28（15）：1-4.

[7] 樓巧君，陳亮，羅利軍.三種水稻基因組DNA快速提取方法的比較[J].分子植物育種，2006，3（5）：749-752.

[8] 李筱婷，陳卓君，許文濤，等.一種適于 PCR 擴增的植物基因組DNA快速提取新方法[J].農業生物技術學報，2010，18（2）：394-399.

[9] 張曉祥，王玲，壽路路.一種快速提取小麥基因組DNA的改良 CTAB 方法[J].中國農學通報，2012，28（36）：46-49.

[10] JAMES CLIVE.ISAAA Report on Global Status of Biotech/GM Crops：2013[J].China Biotechnology，2014，34（1）：1-8.

[11] 黃大昉.加快發展現代農業，大力推進轉基因生物育種產業化[J].中國農業科技導報，2007，9（3）：9-12.