Plackett睟urman和Box睟enhnken Design設計優化促進紅松多酚合成誘導條件的研究

劉冉 王振宇 尹紅力 李婷婷

摘要 [目的]優化促進紅松多酚合成的誘導條件。[方法]以紅松不定芽為試驗材料，通過單因素試驗、PlackettBurman 設計試驗和BoxBenhnken Design設計試驗研究8種誘導子（苯丙氨酸、肉桂酸、茉莉酸甲酯、水楊酸、殼聚糖、酵母提取物、鑭、銪）對紅松不定芽中多酚合成的影響，并且對促進多酚合成的誘導子組合條件進行優化。[結果]除了肉桂酸外， 其他7種誘導子都能不同程度地提高多酚含量。PlackettBurman 試驗確定了3種影響多酚合成的關鍵因素：殼聚糖、鑭和茉莉酸甲酯。BoxBenhnken Design試驗對3種關鍵因素（殼聚糖、鑭、茉莉酸甲酯）協同作用的誘導條件進行優化，優化得到的最佳誘導條件為：殼聚糖濃度79.58 mg/L、鑭濃度42.21 μmol/L、茉莉酸甲酯濃度16.63 μmol/L，預測多酚含量最高可達到14.28 mg/g，實際多酚含量為13.42 mg/g，與對照組相比提高了122.19%。[結論]PlackettBurman 設計結合BoxBenhnken Design響應面分析法可以很好地對促進多酚合成的誘導條件進行優化，3種誘導子（殼聚糖+鑭+茉莉酸甲酯）協同組合比單一誘導子更有效地提高紅松不定芽中多酚含量，更有利于地促進多酚的合成。

關鍵詞 紅松；多酚；誘導子；協同作用

中圖分類號 S791.26；Q946.889 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）27-09269-05

Optimization of Induction Conditions of Promoting the Synthesis of Polyphenols from Pinus koraiensis by PlackettBurman and BoxBenhnken Design

LIU Ran¹， WANG Zhenyu1，2*， YIN Hongli¹et al

（1. College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040； 2. School of Food Science and Engineering， Harbin Institute of Technology， Harbin， Heilongjiang 150090）

Abstract [Objective]The research aimed to optimize the induction condition of promoting the synthesis of polyphenols of Pinus koraiensis. [Method]The adventitious buds of Pinus koraiensis were used to study the effects of 8 inductors on the synthesis of polyphenols by singlefactor test， PlackettBurman design test and BoxBenhnken design test. 8 kinds of inductors were phenylalanine， cinnamic acid， methyl jasmonate， salicylic acid， chitosan， yeast extract， lanthanum and europium. The condition of promoting the synthesis of polyphenols inducers combination was optimized. [Result]Besides cinnamic acid， 7 kinds of inductors could improve the content of polyphenols in different degrees. 3 kinds of key factors which influenced the synthesis of polyphenols were established by PlackettBurman design test： chitosan，lanthanum and methyl jasmonate. The induciton conditions with 3 kinds of key factors were optimized by BoxBenhnken design test. The optimal induction condition was as follows： chitosan concentration 79.58 mg/L， lanthanum concentration 42.21 μmol/L and methyl jasmonate 16.63 μmol/L. The predicted value of the content of polyphenols was 14.28 mg/g and its experimental value was 13.42 mg/g. Compared with the control group， the content of polyphenols was increased by 122.19%. [Conclusion]The combination of PlackettBurman design and BoxBenhnken design response surface analysis could optimize the induction condition of promoting the synthesis of polyphenols well. The combination of 3 inductors （chitosan+lanthanum+methyl jasmonate） could more effectively improve the content of polyphenols， be more conducive to promote the synthesis of polyphenols than a single inductor in adventitious buds of Pinus koraiensis.

Key words Pinus koraiensis； Polyphenols； Inductor； Synergy

紅松（Pinus koraiensis）是中國東北地區的優勢樹種，是一種藥用裸子植物，具有極高的經濟價值。多酚類物質是從植物中分離出來的一類次生代謝產物。由于其獨特的化學結構，它具有顯著的生理活性如抗氧化、螯合金屬、調節酶的活性、調節細胞增殖等，有助于預防癌癥和心腦血管疾病的發生^[1-2]。紅松多酚可以作為一種天然、無毒、高效的抗氧化劑廣泛應用于食品、保健品和醫藥領域，因此如何采取有效的措施提高紅松多酚含量具有重要的意義。在植物次生代謝過程中，某些生物誘導子（如酵母提取物、真菌菌絲體和植物細胞壁片斷等）或非生物誘導子（如植物激素、稀土元素、紫外線、重金屬等）能作為一種特定的信號，誘導特定基因的表達，從而調節植物細胞次生代謝產物的合成^[3]。誘導子目前被廣泛應用于植物細胞培養領域來提高天然產物的產量，有效地促進許多次生代謝產物如萜類、生物堿類、多酚類等物質的合成^[4-5]。添加誘導子已被證明是提高植物次生代謝產物的有效方法，而能否利用誘導子之間的相互作用來發掘更大的植物生產次生代謝產物的能力成為新的研究熱點^[6]。筆者首先研究了8種誘導子（苯丙氨酸、肉桂酸、茉莉酸甲酯、水楊酸、殼聚糖、酵母提取物、鑭、銪）對紅松不定芽多酚中多酚含量的影響，初步篩選有利于多酚合成的誘導子種類和誘導濃度的參考范圍。在此基礎上，采用PlackettBurman 試驗篩選影響多酚含量的關鍵因素，然后利用響應面分析法研究3種誘導子的協同作用對紅松不定芽中多酚合成的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

成熟的紅松種子來源于小興安嶺地區的伊春紅松林，采集后保存于-4 ℃的冰箱中。

1.2 紅松幼苗的培養

將成熟紅松種子滅菌后剝去胚乳，將完整胚作為外植體接種在DCR固體培養基上，25 ℃黑暗培養7 d，將此時誘導生成的紅松不定芽作為各種誘導子處理的原材料。

1.3 誘導子處理

將苯丙氨酸、肉桂酸、茉莉酸甲酯、水楊酸、殼聚糖、酵母提取物、硝酸鑭、氧化銪8種誘導子配制成溶液，過濾、滅菌后添加到DCR培養基，使得最終培養基中誘導子濃度達到設計的不同濃度梯度，以未添加誘導子作為對照。所有的處理設3次重復。每個培養瓶中接種6株紅松不定芽，25 ℃黑暗培養8 d后收獲，測定鮮重增長率和多酚含量。

1.4 紅松不定芽鮮重增長率的測定

鮮重增長率=[（收獲重量-初始重量）/初始重量]×100%

1.5 多酚提取和含量測定

多酚提取采用超聲波提取法，收集培養8 d的新鮮紅松不定芽約1.0 g進行液氮研磨，加入 20 ml濃度60%乙醇提取液，超聲功率150 W、溫度30 ℃提取2 h后，在5 000 r/min下離心10 min，定容到25 ml容量瓶中，即為多酚提取液。

取2 ml多酚提取液，用蒸餾水定容到10 ml容量瓶中，作為多酚含量測定樣品。具體方法按照參考文獻[7]的方法進行。沒食子酸作為標準樣品，其標準曲線為：

y=0.011 1x（R²= 0.999 2）

式中，x為沒食子酸濃度，μg/ml。

1.6 PlackettBarman法篩選影響多酚合成的主要因素

選用試驗次數N=7的PlackettBurman試驗設計，考察了苯丙氨酸、鑭、銪、水楊酸、酵母提取物、殼聚糖、茉莉酸甲酯7個因素，每個因素取2個水平，以多酚含量Y（mg/g）為響應值。每個因素取2個水平：低水平“-1”和高水平“+1”。采用minitab 15.0對數據進行回歸分析。

1.7 響應面試驗設計

根據PlackettBarman試驗結果，利用Minitab15.0軟件，根據BoxBenhnken的中心組合試驗設計原理，設計殼聚糖濃度、鑭濃度、茉莉酸甲酯濃度三因素三水平響應面分析試驗，優化殼聚糖+鑭+茉莉酸甲酯協同作用的誘導條件。

2 結果與分析

2.1 8種誘導子對紅松多酚含量影響的單因素試驗

2.1.1 前體物質對紅松多酚合成的影響。

多酚作為一類重要的次生代謝產物，通過苯丙烷代謝途徑合成。苯丙烷代謝途徑上的第一步反應是L苯丙氨酸在PAL催化形成反式肉桂酸，是苯丙烷代謝途徑上的第一個反應，因此苯丙氨酸和肉桂酸是松多酚合成重要的前體物質^[8]。

由圖1可知，紅松不定芽中多酚含量隨苯丙氨酸濃度的提高呈現出先增加后降低的趨勢。當苯丙氨酸的濃度達到2.00 mmol/L時，多酚含量達到最大值，為（9.47±0.47）mg/g，與對照組相比提高56.79%，說明2.00 mmol/L最有利于紅松不定芽中多酚類物質的合成。高濃度的苯丙氨酸（600 mmol/L）處理紅松不定芽，多酚含量低于對照組。這是由于高濃度的苯丙氨酸對紅松不定芽細胞產生毒害作用，使得細胞活力降低，多酚合成的能力也降低。因此，苯丙氨酸的最佳添加濃度為2.00 mmol/L。

由圖2可知，低濃度（0.05～0.20 mmol/L）的肉桂酸對紅松不定芽多酚含量的影響與對照組相比無明顯差異，而高濃度（0.50～2.00 mmol/L）的肉桂酸顯著降低了多酚含量。結果表明，前體物質肉桂酸并不能促進紅松不定芽中多酚的合成，反而對多酚的合成起抑制作用。

在植物細胞培養領域，前體物質飼喂是一種常見且有效地提高次生代謝產物合成的手段。郭麗梅等^[9]研究了前體物質對粉葛（Pueraria Lobata）細胞次生代謝的影響，發現低濃度的苯丙氨酸對總黃酮積累有較大的促進作用，而肉桂酸對粉葛細胞中黃酮含量的影響不明顯。這與該試驗結果基本一致。

2.3.3 回歸模型的驗證。

考慮到實際操作的可行性，將紅松多酚合成的優化條件在回歸方程得到的理論值基礎上修正為殼聚糖濃度80 mg/L、鑭濃度42 μmol/L、茉莉酸甲酯濃度17 μmol/L，在此條件下進行3組平行試驗，多酚的平均含量為13.42 mg/g，相對誤差為6.02%，略低于預測值。通過殼聚糖+鑭+茉莉酸甲酯協同組合，與3種單一誘導子的誘導效果進行比較。由表4可知，殼聚糖+鑭+茉莉酸甲酯協同作用更有利于紅松不定芽中多酚含量的提高，對多酚合成的促進效果最佳。

3 結論

該研究選取8種誘導子，研究對紅松不定芽中多酚合成的影響，其中苯丙氨酸和肉桂酸屬于前體物質，茉莉酸甲酯和水楊酸屬于植物激素，殼聚糖和酵母提取物屬于生物誘導子，鑭和銪屬于稀土元素。單因素試驗結果表明，除了肉桂酸不能提高紅松不定芽中多酚含量以外，其他7種誘導子都能在不同程度提高多酚含量，促進多酚合成。PlackettBurman試驗結果顯示，7種誘導子因素影響多酚含量的顯著性大小依次為殼聚糖>鑭>茉莉酸甲酯>苯丙氨酸>銪>水楊酸>酵母提取物，確定影響多酚含量的3種關鍵因素為殼聚糖、鑭、茉莉酸甲酯。通過對殼聚糖-鑭-茉莉酸甲酯組合誘導條件進行BoxBenhnken Design響應面優化試驗，優化得到的最佳誘導條件為殼聚糖濃度79.58 mg/L、鑭濃度4221 μmol/L、茉莉酸甲酯濃度16.63 μmol/L，預測多酚含量最高可達14.28 mg/g，實際多酚含量為13.42 mg/g，與對照組相比提高122.19%。同時，3種誘導子（殼聚糖+鑭+茉莉酸甲酯）協同組合比單一誘導子具有更佳的誘導多酚合成的效果。因此，利用誘導子之間的協同作用是一種有效的提高植物生產次生代謝產物合成能力的途徑。

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