一株生防內生真菌D202對立枯絲核菌的抑制作用及生理學特性研究

宋小雙 鄧勛 遇文婧 尹大川 宋瑞清

摘要 [目的]為評價內生真菌D202的生防價值以及生理學特性。[方法]通過對峙培養和非揮發性代謝產物抑菌實驗，測定生防內生真菌D202對立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）的抑制作用，并且對其生理學學特性進行了研究。[結果]拮抗試驗中D202對絲核菌的抑制率為67.25%，相對抑制效果為3.54，其非揮發性代謝產物對絲核菌的抑制率為72.35%，菌株D202及其代謝產物可有效抑制立枯絲核菌的生長；內生菌株D202生長最適碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨，在溫度為25℃、培養基pH為7時菌落生長最好。[結論]篩選得到的生防內生菌D202具有開發生物源殺菌劑的潛力。

關鍵詞 深色有隔內生真菌；生防內生菌；立枯絲核菌；抑制作用；生物學特性

中圖分類號 S188 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）27-09274-02

Inhibiting Effect of Dark Septate Endophyte Fungi D202 on Rhizoctonia solani and Its Physiological Characteristics

SONG Xiaoshuang¹， DENG Xun²， YU Wenjing¹， SONG Ruiqing2* et al

（1.Heilongjiang Forestry Protect Institute， Harbin， Heilongjiang 150040； 2.Northeast Forestry University， Harbin Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective]The research aimed to evaluate the biocontrol ability and physiological characterisitics of endophyte strain D202. [Method]Dark septate endophyte fungi D202 was evaluated against R. solani in confront culture and through production of nonvolatile inhibitors， and the physiological characteristics of D202 were researched by growth rate method. [Result] In the dual culture， D202 could inhibit the growth of R.solani effectively， the inhibition rate was 67.25%， and relative inhibit rate was 3.54. The nonvolatile antibiotics inhibited the growth of R.solani effectively， and the inhibit rate was 72.35%. Strain D202 could grow well in PDA media whose pH was 7.0. The optimum carbon sources for D202 growing were glucose， and the optimum nitrogen sources were peptone， and the optimum temperature for growing was 25 ℃.[Conclusion]Endophyte D202 had the potential to develop biocontrol agents.

Key words Dark septate endophyte fungi； Biological controls endophytes； Rhizoctonia solani； Inhibiting effect； Physiological characteristics

隨著化學藥劑的過度使用，土壤微生態環境被破壞，苗木長勢不良以及有害生物的抗藥性等問題日益突出，環境和諧性病蟲害防控技術日益受到重視。同時，農副產品的綠色健康已成為關注的焦點，因此現代農林業的發展要求減少化學藥劑的使用，發展以生物防治為核心內容的生態控制技術。在當前提倡的土壤保健和植物保健技術等土壤生物修復和生態調控理念中，通過引入植物根際有益微生物和生防菌株，可以改善土壤環境，促進苗木生長，提高植物抗逆性^[1]。因此，篩選高效菌株，開發生物源的生防菌劑日益受到人們的關注。

深色有隔內生真菌（DSE）是植物根部的內生菌。在高寒、干旱、污染土壤以及鹽堿環境等極端和逆境環境下，它均可與宿主植物形成互惠的共生關系^[2]，在促進植物生長、改善礦物質吸收、病害生物防治、提高植物抗逆性等方面作用顯著^[3-4]。在病害防治方面，DSE真菌可以在宿主根系定殖，并且有效抑制土傳病害的發生，在防治白菜根腫病^[5-6]和番茄枯萎病上^[7]均取得實際的控制效果。此外，通過誘導植物抗性，對葉部病害也有一定的預防作用。深色有隔內生真菌D202是從針葉樹根部分離得到的內生真菌。通過形態鑒定和ITS測序，它屬于Phialocephala fortinii s.l.Acephala applanata species complex （PAC），為典型的植物根部深色有隔內生真菌。在前期篩選中，它對立枯絲核菌具有強烈的抑制作用，具有開發生防菌的潛力。筆者通過平板對峙培養和發酵液抑菌試驗，測定了D202菌株對立枯絲核菌的抑制作用，并且對其生物學特性進行研究，為進一步研究其抑菌機理和田間應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試深色有隔內生真菌D202（Phialocephala fortinii）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）SH均保存于東北林業大學森林微生物實驗室。

1.2 深色有隔內生真菌D202對立枯絲核菌的抑制作用研究

采用平板對峙培養法^[8]，測定菌株D202對立枯絲核菌的拮抗作用。由于生長速度差異，采用先內生真菌后絲核菌的錯時培養方培進行拮抗試驗，測量菌落半徑，計算抑制率、相對抑制效果。每個處理3次重復。

抑制率（%）=[（對照菌落半徑-對峙培養菌落半徑）/對照菌落半徑]×100%

相對抑制效果=病原菌株被抑制率/拮抗菌株被抑制率

采用菌絲生長抑制法^[9]，測定菌株D202非揮發性代謝產物對四核菌生長的抑制作用，過濾，收集發酵液后，添加到PDA培養基中，培養絲核菌，采用十字交叉法測量病原菌的菌落直徑，計算菌株D202代謝產物中抑菌活性成分對病原菌生長的抑制率。每個處理3次重復。

抑制率（%）=[（對照菌落半徑-抑制培養菌落半徑）/對照菌落半徑]×100%

1.3 深色有隔內生真菌D202生理學特性研究

1.3.1 不同溫度對菌絲生長的影響。將D202菌落接種到PDA培養基上，分別在10、15、20、25、30、35 ℃恒溫培養箱中培養。培養14 d后，采用十字交叉法測定菌落直徑。每個處理3次重復。

1.3.2 不同碳源對菌絲生長的影響。碳源培養基配方改良PDA培養基，將不同碳源包括甘露醇、 蔗糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖、淀粉、麥芽糖替代葡萄糖，制備不同碳源培養基碳源添加量為20 g/L，接種菌株D202后，置于25 ℃恒溫培養箱中培養。培養14 d后，采用十字交叉法測定菌落直徑。每個處理3次重復。

1.3.3 不同氮源對菌絲生長的影響。氮源培養基為改良PDA中添加2 g氮源。供試氮源包括甘氨酸、硝酸鈣、蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、酒石酸銨、硝酸銨，制備不同氮源培養基，氮源添加量為2 g/L接種菌株D202后，置于25 ℃恒溫培養箱中培養。培養14 d后，采用十字交叉法測定菌落直徑。每個處理3次重復。

1.3.4 不同pH對菌絲生長的影響。用1 mol/L HCl和NaOH分別調節改良PDA培養基pH為5、6、7、8、9，制備不同pH的改良PDA培養基，接種菌株D202后置于25 ℃恒溫培養箱中培養。培養14 d后，采用十字交叉法測定菌落直徑。每個處理3次重復。

2 結果與分析

2.1 菌株D202對立枯絲核菌的抑制作用

在對峙培養中，菌株D202可以有效抑制絲核菌的生長（圖1），2個菌落未形成拮抗線，但可以判斷D202在PDA培養基上生長時代謝出抑菌活性成分，抑制絲核菌的生長，生防菌株的作用機理包括重寄生、競爭作用和代謝活性成分，而D202的抑菌機理主要可以代謝抑菌活性成分，D202對絲核菌的抑制率為67.25%，相對抑制效果3.54，在有效抑制絲核菌生長的同時，自身生長未受到明顯抑制。菌株D202的非揮發性代謝產物具有強烈的抑制絲核菌生長的作用，其非揮發性代謝產物對絲核菌的抑制率為72.35%，D202非揮發性代謝產物的熱穩定性較好，高溫滅菌處理后抑菌率為50.15%，絲核菌在含有D202的非揮發性代謝產物的培養基上長勢很弱，菌絲生長稀疏，氣生菌絲較多。

2.2 深色有隔內生真菌D202生物學特性

2.2.1 溫度對菌落生長的影響。由圖2可知，菌株D202在 10～35 ℃范圍內均可生長，生長的最佳溫度范圍20～30 ℃，可耐低溫，菌株在25 ℃下培養生長速度最快，14 d后菌落直徑達到5.24 cm，低于10 ℃和高于35 ℃時，菌落生長較慢。

2.2.2 碳源對菌落生長的影響。由圖3可知，在所有供試碳源中，菌株D202均可生長，對葡萄糖、蔗糖和淀粉的利用率較高，在碳源為葡萄糖時菌落生長速度最快，培養14 d后菌落直徑可達5.21 cm；橫向比較，菌株D202對甘露醇、乳糖和半乳糖的利用率較低。

2.2.3 氮源對菌落生長的影響。由圖4可知，不同氮源對菌株D202生長的影響較小。菌株可很好地利用各種有機氮和無機氮，對蛋白胨的利用率最高，培養14 d后菌落直徑可達到5.18 cm。該菌株對氮源無特殊要求。在缺乏氮源的改良PDA培養基培養條件下，菌落依然生長良好。

2.2.4 pH對菌落生長的影響。由圖5可知，在不同pH條件下，菌株D202均可生長。在中性偏酸條件下，菌絲生長迅速，菌落濃密旺盛，而偏堿性時菌株生長受到一定的抑制作用。在pH為7時，培養14 d后菌落直徑可達5.19 cm，說明該菌株的生長環境偏酸，不喜好在偏堿性環境中生長。

拮抗試驗中D202對絲核菌的抑制率為67.25%，相對抑制效果3.54，其非揮發性代謝產物對絲核菌的抑制率為72.35%。上述結果表明，菌株D202及其代謝產物可有效地抑制立枯絲核菌的生長，具有生防菌的開發價值。生理學特性研究結果表明，當內生菌株D202生長的碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨，溫度為25 ℃，培養基pH為7時，菌落生長最好。

參考文獻

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