不同前體對黃芪懸浮培養細胞中黃芪多糖積累的影響

楊靜

摘要 [目的]研究苯丙氨酸、草酸和油酸等前體對黃芪細胞生長和黃芪多糖合成的影響。[方法]在細胞培養的第0天，向細胞懸浮培養液中加入3種前體，測定細胞干重增殖倍數和黃芪多糖的含量。[結果]添加2 mmol/L的草酸可以明顯地促進黃芪細胞中黃芪多糖的積累，其含量為對照組的1.80倍；較低濃度苯丙氨酸能有效促進黃芪細胞中黃芪多糖的合成；當苯丙氨酸濃度為1.0 mmol/L，黃芪多糖的含量達最大，為33.429 mg/g，為對照組的1.70倍；當油酸添加濃度由0.1 mmol/L增加至2 mmol/L時，細胞中黃芪多糖的含量逐漸提高；2 mmol/L的油酸使黃芪多糖的含量達37.565 mg/g，為對照組的1.91倍。[結論]前體的添加可有效促進黃芪懸浮培養細胞中黃芪多糖的積累。

關鍵詞 前體；黃芪多糖；積累；細胞懸浮培養；黃芪

中圖分類號 S567 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）27-09317-03

Effect of Different Precursors on Accumulation of Astragalus Polysaccharides in the Suspension Culture Cell of Astragalus membranaceus

YANG Jing （Tianjin Bohai Vocational and Technical College， Tianjin 300402）

Abstract [Objective] To investigate the effects of different precursors （oxalic acid， phenylalanine， oleic acid） on the cell growth and the formation of astragalus polysaccharides in Astragalus membranaceus cells. [Method] The three kinds of precursors were added to the suspension culture cell on the day 0. Then the cell growth rate and the astragalus polysaccharides content in Astragalus membranaceu cells were determined. [Result] The addition of 2 mmol/ L oxalic acid could significantly increase the accumulation of astragalus polysaccharides by about 1.80 times than the control. The low concentration of phenylalanine can effectively stimulate the synthesis of astragalus polysaccharides. The content of astragalus polysaccharides reached 33.429 mg/g by adding 1.0 mmol/L phenylalanine， and it was 1.70 times as that of control. With the addition of 2 mmol/L oleic acid， astragalus polysaccharides content reached to 37.565 mg/g by 1.91 times than the control. [Conclusion] The addition of the precursors was effective to promote the formation of astragalus polysaccharides in Astragalus membranaceus cells.

Key words Precursors； Astragalus polysaccharides； Accumulation； Suspension culture cell； Astragalus membranaceus

黃芪又名北芪、元芪或黃耆，豆科多年生草本植物，根為重要的中藥材。目前我國可供藥用的黃芪品種很多，但主要以膜莢黃芪和蒙古黃芪為主。傳統中醫學認為，黃芪具有補氣固表、利尿排毒、斂瘡生肌、補中益氣等功效^[1]。現代藥理研究表明，黃芪具有增強機體免疫功能、強心降壓、降血糖、利尿、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、抗病毒、鎮靜、鎮痛等作用^[2]。由于黃芪藥性溫和，素有補氣固表之“圣藥”的美譽。以黃芪為原料生產的中成藥多達200余種，著名的“補中益氣湯”就是由黃芪配伍而成。黃芪中含有多糖、皂苷、黃酮、氨基酸和微量元素等多種有效成分，其中黃芪多糖（Astragalus Polysacharin，APS）是黃芪的主要活性成分之一，具有增強機體抵抗力、促進免疫、促進抗體合成、雙向調節血糖和保護心血管系統等作用，可作為免疫促進劑或調節劑，廣泛應用于中醫臨床^[3]。

目前，隨著保健藥的日益暢銷，黃芪的需求量持續增加，市場大量需求導致野生資源的過度采挖，野生黃芪瀕臨滅絕。商品中藥材的黃芪主要來源于人工栽培，但受季節變換和病蟲害的影響，品質和產量均有所下降。采用植物組織培養技術生產植物的有效成分，是解決藥材資源問題有效途徑之一，也是對藥材生產的根本性改革。黃芪組織培養方面的報道多集中在黃芪愈傷組織培養和分化及不定根培養方面的研究^[4-5]，對黃芪細胞懸浮培養的研究很少，且利用不同前體添加的手段提高黃芪細胞中黃芪多糖合成的研究還未有報道。該試驗考察了苯丙氨酸、油酸和草酸等3種前體對黃芪細胞生長和黃芪多糖合成的影響，以期為黃芪細胞大規模培養生產黃芪多糖提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料 黃芪種子（北京時珍中草藥研究所），經樂仁堂制藥廠中心化驗室鑒定為Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge.的種子。黃芪多糖對照品、葡萄糖對照品購自中國藥品生物制品檢定所。苯丙氨酸、油酸和草酸等試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.2 儀器

202型電熱恒溫干燥箱；TCYQ ZYSA0351型超大型搖床；BCN-1360型凈化工作臺；Sartorius BS 2202S型電子天平；UV- 7500紫外分光光度計；HPG280B強光照培養箱等。

1.3 方法

1.3.1 黃芪無菌苗的獲得。

選擇飽滿的黃芪種子于70%的乙醇中浸泡1 min，用無菌水沖洗2次，然后用2%次氯酸鈉溶液進行表面消毒30 min后，用無菌水浸洗5次。將已滅菌的種子接入培養基，培養條件為MS+3%蔗糖+瓊脂1%、pH5.8、光照16 h培養，4～5 d后種子萌發，20 d后試管苗長勢良好。

1.3.2 愈傷組織的誘導和繼代培養。

取黃芪無菌苗的幼嫩葉片，自來水沖洗干凈，75%酒精消毒30 s，0.1% HgCl₂消毒7 min，然后無菌水沖洗4次，無菌濾紙吸干水分，切成0.5 cm²的小塊，接種到誘導培養基上培養，培養條件為MS+0.5 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA+2.0 mg/L NAA+3%蔗糖+1%瓊脂、pH5.8、黑暗培養、（24±1）℃，挑選生長良好的愈傷組織，稱重后繼代培養，每四周繼代一次，繼代培養基中添加2.0 mg/L 6BA，其他同誘導培養基，培養條件同前。以上培養基接種前須經高壓滅菌，滅菌溫度121 ℃，滅菌時間20 min。

1.3.3 黃芪細胞株的獲得。

將愈傷組織（約2 g鮮重）轉移到含50 ml液體的培養基（MS+0.5 mg/L 2，4D+1.0 mg/L 6BA+3%蔗糖，pH5.8）的250 ml錐形瓶中懸浮培養，每15 d繼代一次，在繼代培養過程中，將大塊尚未分散的愈傷組織去除，同時去除褐化的愈傷組織，懸浮培養時，搖床的轉速為120 r/min，（22±1）℃，暗培養。

1.3.4 前體飼喂試驗。

油酸用無水乙醇溶解，配成試驗用濃度的溶液。苯丙氨酸、草酸和油酸使用前均用微孔濾膜（0.45 μm）進行過濾除菌。在培養的第0天向培養基中分別加入0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L的3種前體。培養基pH5.8，搖床轉速120 r/min，每組重復 3～4瓶，以未添加前體的組分作為對照。培養第18天收獲黃芪細胞。

1.3.5 生物量的測定。

將懸浮細胞液置于離心管中，轉速8 000 r/min，離心15 min，棄去上清液，用蒸餾水洗滌細胞2～3次，棄去上清液，稱得沉淀細胞質量，即為細胞鮮重，置于烘箱中60 ℃干燥7～8 h以至恒重，稱其質量為細胞干重。干重增殖倍數=（收獲時細胞干重-接種時細胞干重）/接種時細胞干重。

1.3.6 黃芪多糖的含量測定。

1.3.6.1 樣品溶液的制備^[6]。

取黃芪細胞培養物50 ℃下烘干至恒重，粉碎，準確稱取1.500 g，用濾紙包好置索氏提取器中加入70%的乙醇提取3 h，揮干濾紙包中的乙醇，放于小燒杯中加入20倍量的去離子水超聲，提取110 min。水提液濃縮定容于25 ml的容量瓶中備用。

1.3.6.2 對照品溶液的制備。

精密稱取于105 ℃干燥至恒重的 D-無水葡萄糖100 mg，置100 ml量瓶中加水溶解，定容至刻度，搖勻即得1 μg/ml的對照品溶液。

1.3.6.3 黃芪多糖含量測定方法。精密吸取空白對照品和供試品溶液各2 ml于具塞試管中，分別加入5%苯酚溶液10 ml，搖勻，迅速加入5.0 ml 濃硫酸，振搖2 min，置沸水浴中加熱15 min，取出置冷水浴中冷卻30 min，以蒸餾水為空白對照，在490 nm 處測定吸光度。根據回歸方程，計算出相應濃度。試驗所有數據均用 SPSS 11.5軟件進行統計學處理。數據以平均值±標準差（±s）表示。

1.3.6.4 線性范圍考察。

分別精密吸取對照品溶液0.1、02、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 ml的溶液于25 ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，精密吸取上述各溶液2 ml于具塞試管中，按照“1.3.6.3”方法測定吸光度。以吸光度對濃度進行線性回歸，得回歸方程A=68.703C+0.023 9（r=0. 999 5），結果表明，葡萄糖在2.0～14.0 μg/ml線性關系良好。

2 結果與分析

2.1 草酸對黃芪細胞生長及黃芪多糖含量的影響

從草酸對黃芪細胞生長及黃芪多糖含量的影響（表1）可以看出，較低濃度（0.1、0.5 mmol/L）下草酸的添加對黃芪細胞的生長有一定的促進作用，并隨著草酸濃度的增加，黃芪細胞的生物量的積累也逐漸上升；但當草酸濃度高于1.0 mmol/L，對黃芪細胞的生長產生一定的抑制作用；草酸濃度為2.0 mmol/L，黃芪細胞的干重降為對照組的85.65%。而草酸的加入對于黃芪多糖的積累則表現出不一致的結果。試驗濃度范圍內，黃芪多糖含量隨著草酸濃度的增加而增加；當草酸的濃度為2.0 mmol/L，黃芪多糖的含量也達最大，為35.245 mg/g，為對照1.80倍。由此可見，較高濃度的草酸雖然能抑制細胞生長，卻能顯著提高黃芪細胞中黃芪多糖的含量。故在培養的第0天向培養體系中添加較高濃度的草酸（2.0 mmol/L），利于黃芪細胞中黃芪多糖的積累。

NC89懸浮培養細胞中添加了對羥苯甲酸等前體物質，有效提高了輔酶Q10的含量和煙草細胞的干重^[7]。該試驗在黃芪細胞懸浮培養時通過前體的追加來調控黃芪多糖代謝水平，結果發現，草酸的用量對黃芪多糖的合成有較大的影響，較低濃度的草酸能刺激細胞的生長，較高濃度的草酸能促進黃芪多糖的合成，而苯丙氨酸和油酸的添加對黃芪細胞生長和黃芪多糖合成的影響結果相一致，均表現輕微刺激細胞生長和顯著促進黃芪多糖的合成，但二者最佳作用濃度不同。由此可以推斷，前體促進細胞生長和次級代謝產物積累的作用機制可能不同，且前體的用量也是影響了次級代謝產物的合成的重要因素。

在植物細胞的次生代謝中，苯丙氨酸是一個代謝中間體，是生物堿、木質素、黃酮等多種次生代謝物質的生物合成的前體，同時在植物體內可以作為碳源和氮源，并通過參與蛋白質的生物合成來影響細胞生長^[8-9]，因此苯丙氨酸被廣泛用作前體物質附加在植物懸浮培養液中促進次生代謝產物的合成。Mizukami等早在1977年就發現苯丙氨酸可以促進紫草細胞萘醌類化合物的合成^[10]。魏欣方等研究表明一定濃度的苯丙氨酸能促進紅景天苷的產量^[11]。梁曉芳等進行大豆下胚軸懸浮細胞培養體系時，附加了一定濃度的苯丙氨酸，結果不僅顯著提升了懸浮細胞中大豆素的積累，同時還有效促進了染料木素的含量^[12]。植物中草酸長期被認為是一種沒有生理意義的代謝副產物，其對懸浮細胞培養過程中細胞生長和次生代謝物合成的影響也未見報道。但越來越多的研究表明，草酸可以調節植物細胞Ca2+濃度，在植物適應環境脅迫中發揮重要功能^[13-15]。Ca2+是一個重要的第二信使^[16]，能誘導處理能促進次級代謝產物的合成，如周倩耘等分析指出CaCl₂在較低的濃度下明顯促進人參單體皂苷和總皂苷的積累，還能促進人參皂苷的分泌^[17]。在該試驗中較高濃度的草酸促進了黃芪多糖的積累，抑制了細胞生長。邢更妹在研究黃芪組織培養產生多糖的代謝途徑時指出脂肪酸是多糖合成的前體物之一，向黃芪愈傷組織培養體系添加前體物質油酸，黃芪多糖的含量明顯增多^[18]。因此該試驗選擇了油酸為前體進行追加，結果表明較高濃度的油酸能最大幅度提高黃芪多糖的含量。

植物細胞懸浮培養過程中次生代謝物的產量通常較低，目前，提高植物細胞培養過程中次生代謝物產量的方法主要有前體飼喂、添加誘導子、兩相培養、培養條件控制和高產細胞株的篩選等^[19]。許多研究表明2種或多種條件聯合應用會對次生代謝產物的提高起到協同作用，如前體物質、誘導子和光照聯合使用對葡萄細胞花青素含量有顯著影響^[20]。該研究雖然成功地利用前體追加的方法提高了黃芪多糖的含量，但對于前體物質的最佳添加時間、對前體物質利用率高的細胞系篩選和多種促進因子聯合作用等還有待進一步試驗，從而篩選出有利于黃芪懸浮細胞中黃芪多糖積累的有效方法，為黃芪細胞的規模化培養奠定基礎。

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