烯唑醇·苯醚甲環唑和咪鮮胺錳鹽對飾紋姬蛙蝌蚪的急性和聯合毒性

郭賽男 童美玲 陳文君 邵偉偉 林植華 韋力

摘要 [目的]了解3種殺菌劑對水生生物的急性和聯合毒性。[方法]采用靜態換水方法研究了烯唑醇、苯醚甲環唑、咪鮮胺錳鹽3種殺菌劑對飾紋姬蛙蝌蚪的急性毒性及其聯合毒性，并對其進行了安全性評價。[結果]在急性毒性試驗中，烯唑醇在24、48和72 h的半致死濃度（LC50）分別為60.80、62.40和41.20 mg/L；苯醚甲環唑的LC50分別為11.50、10.40和9.00 mg/L；咪鮮胺錳鹽的LC50分別為4930、6.40和3.00 mg/L；烯唑醇、苯醚甲環唑、咪鮮胺錳鹽對飾紋姬蛙蝌蚪的安全濃度（SC）分別為19.90、2.50和0.03 mg/L。在聯合毒性試驗中，烯唑醇+苯醚甲環唑的聯合毒性和咪鮮胺錳鹽+苯醚甲環唑聯合毒性均表現為協同作用，咪鮮胺錳鹽+烯唑醇聯合組中除了0.6U+0.4U毒性比組均表現為協同作用外，其他3個毒性比組均表現為拮抗作用。[結論]為進一步了解農藥對兩棲類的毒性影響以及農藥在農業中的合理使用提供了參考。

關鍵詞 烯唑醇；苯醚甲環唑；咪鮮胺錳鹽；急性毒性；聯合毒性；飾紋姬蛙；蝌蚪

中圖分類號 S189 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）27-09350-04

Acute and Joint Toxicity of Diniconazole， Difenoconazole and Prochlorazmanganese Chloride Complex to Microhyla ornata Tadpoles

GUO Sainan， TONG Meiling， CHEN Wenjun， WEI Li* et al

（College of Ecology， Lishui University， Lishui， Zhejiang 323000）

Abstract [Objective]The aim was to understand acute and joint toxicity of three fungicides against aquatic organisms. [Method] Used Microhyla ornata tadpoles as experimental model， the acute toxicity， jonit toxicity and safety evaluation of three different pesticides （diniconazole， difenoconazole and prochlorazmanganese chloride complex） were studied by the method of stability water tests. [Result] In acute toxicity test， the LC50 of diniconazole examined at 24， 48 and 72 h were 60.80， 62.40 and 41.20 mg/L， respectively， whereas those of difenoconazole and prochlorazmanganese chloride complex were 11.50， 10.40， 9.00 mg/L and 49.30， 6.40 and 3.00 mg/L， respectively. The SC of diniconazole， difenoconazole and prochlorazmanganese chloride complex to M. ornata tadpoles were 19.90， 2.50 and 0.03 mg/L， respectively. Among the pairwise combinations of the three pesticides， the toxicity of diniconazole+difenoconazole and prochlorazmanganese chloride complex+difenoconazole combinations showed synergistic. For the joint toxicity of prochlorazmanganese chloride complex+diniconazole combination， except 0.6U+0.4U combination showed synergistic， the other treatments showed antagonistic. [Conclusion] The results provide valuable information on the toxic effects of pesticides on amphibians and how various types of pesticides can be reasonably used in agricultural areas.

Key words Diniconazole； Difenoconazole； Prochlorazmanganese chloride complex； Acute toxicity； Joint toxicity； Microhyla ornata； Tadpoles

兩棲類是生態系統中不可缺少的成員，既能影響營養物質的循環，也可作為許多物種的高質量獵物^[1]。近20年來，科學家找到了加速全球兩棲類衰退的大量證據^[2-3]。兩棲類易受農業污染物的威脅，因為它們有滲透性的皮膚和卵，易從環境吸收化學污染物，大多數兩棲類的生活史在農藥使用區域完成，其胚胎易受污染物危害，其幼體發育時間與農藥使用時間一致，因此對污染物極敏感^[4]。

幾十年來隨著農藥使用的不斷增多，其對兩棲類動物的生態影響也越來越多^[5-7]。農藥具有影響許多水生生物類群的潛力，人們對兩棲動物的影響在過去幾十年里尤為關注，因為許多物種在全球有明顯的衰退現象[2-3，8]。據報道，全球兩棲類種群衰退的最大原因是環境問題^[9]，農藥化學品排放到自然環境經常導致生境惡化及局部兩棲類動物種群的滅絕。然而，在我國大部分地區，農藥使用仍然十分普遍，每年有很大農藥劑量流入環境或水體中，造成不同程度的污染。因此，以兩棲類作為生物指示劑對環境污染物進行監測是十分有效的方法。

飾紋姬蛙（Microhyla ornata）是無尾兩棲類最小的物種之一，廣泛分布于我國西北、華中、華南、華東和西南地區，常在田邊、臨時性水塘及其附近草叢中活動和捕食^[10]。筆者研究了3種農藥殺菌劑（烯唑醇、苯醚甲環唑和咪鮮胺錳鹽）對飾紋姬蛙蝌蚪的急性及其聯合毒性，旨在為農業生產合理使用農藥、保護飾紋姬蛙及其他兩棲類動物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試動物。

于麗水學院校園內水洼中撈取飾紋姬蛙卵團，帶回實驗室，置于60 cm ×40 cm× 30 cm的塑料箱內，加入曝氣水20 cm，自然條件下孵化。孵化后用水藻喂食蝌蚪。7日齡時，挑選大小均一[體長（5.023±0.065）mm，體重（0.010±0.002）g]、健康活潑的蝌蚪供試驗用。

1.1.2 供試藥劑。

烯唑醇（WP，12.5%）和咪鮮胺錳鹽（WP，50%）均為江蘇輝豐農化股份有限公司生產；苯醚甲環唑（EC，250 g/L）為廣東省江門市植保有限公司生產。試驗前，統一配制好每一種農藥的原液濃度：烯唑醇為1 000.0 mg/L，咪鮮胺錳鹽和苯醚甲環唑均為100.0 mg/L。試液在試驗前用干凈的曝氣水進行稀釋。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗。

參考Wei等的試驗結果^[11]，采用“靜態-換水式”的毒性試驗方法^[12]。將烯唑醇、苯醚甲環唑、咪鮮胺錳鹽分別按0.035、0.045和0.150的等對數間距設計5個濃度試驗組（烯唑醇：40.0、43.0、46.8、50.7、55.0 mg/L；苯醚甲環唑：8.0、8.8、9.8、10.8、12.0 mg/L；咪鮮胺錳鹽：2.0、2.8、4.0、5.6、8.0 mg/L），并另設一個空白對照組，每個試驗組設置3個平行。試驗使用容積為1 L的塑料圓盒，各組試驗藥水為500 ml，每個盒子放10尾蝌蚪，整個試驗在室溫下進行。在毒性試驗期間，不投食，每24 h更換一次試液。記錄24、48和72 h飾紋姬蛙蝌蚪的死亡數。判斷蝌蚪死亡的標準是用鑷子輕夾蝌蚪的尾部，若無反應，即認為蝌蚪已死亡[11，13]。

1.2.2 聯合毒性試驗。

根據急性毒性試驗結果，計算出每種農藥在不同染毒時間的LC50，以每種農藥在48 h的LC50值作為一個毒性單位（U），分別按比例（表1）進行3種農藥兩兩聯合，進行聯合毒性試驗^[14]，每組試驗設置3個平行組，并設1個對照組。結果觀察和記錄方法與“1.2.1”相同。

1.2.3 數據處理。

1.2.3.1 農藥濃度對蝌蚪死亡率的影響比較。

單一農藥的不同濃度在相同染毒時間內對蝌蚪死亡率的影響，分別采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）和Tukeys多重比較對相關數據進行統計。統計前，先對同一染毒時間內的不同農藥濃度試驗組數據進行正態性和方差齊性檢驗。為進一步確定每種農藥不同濃度、不同染毒時間以及兩者的交互作用對蝌蚪死亡率的影響，采用重復檢驗方差分析（Repeated measures ANOVA）進行統計。用Statistica 6.0軟件進行統計，數據均以平均值表示。

1.2.3.2 LC50和SC。

參照概率單位法求得各污染物對飾紋姬蛙的24、48和72 h的LC50^[14]。采用經典公式（48 h LC50×0.3）/（24 h LC50/48 h LC50）²計算SC^[15]。最后，根據國家環境保護局對化學農藥環境安全評價試驗準則，將農藥對蝌蚪的毒性劃分為3個等級：LC50>10.0 mg/L為低毒；LC50=1.0～10.0 mg/L為中等毒性；LC50<1.0 mg/L為劇毒^[12]。

1.2.3.3 聯合毒性評價。

根據48 h各試驗組飾紋姬蛙蝌蚪的死亡數，繪制濃度死亡曲線分析確定各毒性比之間聯合作用類型。毒性比試驗組的死亡率大于50%，為協同作用；若小于50%，則為拮抗作用^[14]。

2 結果與分析

2.1 單一農藥對飾紋姬蛙蝌蚪的急性毒性

由表2可知，3種農藥單獨作用于飾紋姬蛙蝌蚪時，在相同染毒時間內（24、48、72 h），其死亡率均有所不同，且不同濃度試驗組之間的死亡率比較均呈顯著性差異。烯唑醇、苯醚甲環唑和咪鮮胺錳鹽的LC50均隨染毒時間的增加而降低（表3），且各自的SC分別為19.90、2.50和0.03 mg/L。根據農藥對水生生物的毒性等級的劃分，烯唑醇為低毒性農藥，苯醚甲環唑為中等毒性農藥，咪鮮胺錳鹽為劇毒性農藥。

重復測量檢驗法統計結果表明，在3個試驗組中，不同農藥濃度和染毒時間均分別對飾紋姬蛙蝌蚪的死亡率影響顯著。同時，在兩者的交互作用時，所有試驗組對蝌蚪死亡率的影響均顯著（表4）。

2.2 3種農藥對飾紋姬蛙蝌蚪的聯合毒性

單因素方差分析結果表明，烯唑醇+苯醚甲環唑聯合試驗組中的不同毒性

比對飾紋姬蛙蝌蚪死亡率的影響差異顯著（df3，8=11.485，

烯唑醇是一種高效、廣譜殺菌劑，對植物的生長調節、生理活性產生影響。目前，烯唑醇主要用于植物病害防治^[16-17]。如趙莉等研究表明烯唑醇對麥蚜蟲的LC50為1.603 0×1012 μg/ml^[18]，為低毒性農藥。該研究表明，烯唑醇在不同的染毒時間（24、48和72 h）對飾紋姬蛙蝌蚪的毒性效應不同，LC50隨染毒時間的延長而降低，SC為19.90 mg/L，也屬于低毒性農藥。不同濃度、不同染毒時間及其兩者的交互作用均對飾紋姬蛙的死亡率影響顯著。

苯醚甲環唑具有殺菌譜廣、高效、安全的特點，自2003年以來在全世界農藥市場中一直銷售量很高，是未來殺菌劑的主流品種之一。該農藥可高效防治銹病、炭疽病、黑斑病、葉枯病、早疫病、瘡痂病、白粉病、莖枯病、斑點落葉病、紫斑病等多種病害。秦紹源等發現10%苯醚甲環唑水分散粒劑對柑橘黑點病進行防治，發現其抑菌濃度（EC50）為0.102 μg/L^[19]。馬雪楠等研究發現30%苯醚甲環唑懸浮劑對蘋果樹褐斑病有較好的防治效果，其5 000倍液的防治效果達到90.96%^[20]。該研究中的苯醚甲環唑對飾紋姬蛙蝌蚪的毒性也較大，24、48和72 h的LC50分別為11.50、10.40和9.00 mg/L，SC為2.50 mg/L，該農藥的不同濃度、染毒時間及其兩者的交互作用均對飾紋姬蛙蝌蚪的死亡率影響顯著。

咪鮮胺錳鹽是咪唑類廣譜性殺菌劑，其有效成分為咪鮮胺、氯化錳復合物，具有保護和鏟除雙重作用，可高效防治花葉病、腐爛病、炭疽病、白粉病、青霉病等。蔡美蘭利用50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑防治芒果炭疽病，發現1 000～2 000倍液對芒果炭疽病具有明顯的防治效果^[21]。秦紹源等利用50%咪鮮胺錳鹽可濕粉對柑橘黑點病進行防治，EC50為0186 μg/L^[19]。該研究中咪鮮胺錳鹽對飾紋姬蛙蝌蚪的毒性作用為劇毒性，24、48和72 h的LC50分別為49.30、6.40和3.00 mg/L，SC為0.03 mg/L，其濃度、染毒時間及其相互作用均對飾紋姬蛙蝌蚪死亡率影響顯著。

在3種農藥的兩兩聯合毒性試驗中發現烯唑醇與苯醚甲環唑、咪鮮胺錳鹽與苯醚甲環唑的聯合毒性均表現為協同作用，而咪鮮胺錳鹽+烯唑醇聯合組中除了0.6U+0.4U毒性比組表現為協同作用外，其他3個毒性比組均表現為拮抗作用。因此，飾紋姬蛙在面對3種單一農藥及其聯合毒性作用時，響應機制可能較復雜，這可能與物種和發育歷期、農藥染毒的持續時間和強度有關^[22]。

該研究報道了烯唑醇、苯醚甲環唑和咪鮮胺錳鹽3種農藥對飾紋姬蛙蝌蚪的急性毒性效應，每種農藥的不同濃度及染毒時間，以及農藥的兩兩聯合作用均對飾紋姬蛙蝌蚪死亡率產生顯著影響。該研究結果可用于烯唑醇、苯醚甲環唑和咪鮮胺錳鹽毒性的監督管理以及我國水體區域的生態監測。

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