角果木Mn—SOD基因分離及其在酵母中的功能鑒定

王鶴鳴等

摘 要 為明確抗氧化系統在植物抵御鹽脅迫中的作用，采用RT-PCR的方法分離角果木抗氧化酶相關基因Mn-SOD，采用酶切連接法構建酵母表達載體pYES2/MnSOD，獲得含有重組質粒的酵母菌INVScⅠ（pYES2/MnSOD）能有效表達MnSOD特異蛋白帶。高濃度鹽脅迫篩選結果表明，Mn-SOD基因在酵母中的表達能明顯提高酵母菌INVSCⅠ的耐鹽性。

關鍵詞 角果木；耐鹽性；Mn-SOD基因；酵母菌

中圖分類號 Q943 文獻標識碼 A

Abstract To study the function of antioxidant system against salt stress， the MnSOD gene from Ceriops tagal was cloned by RT-PCR. The Mn-SOD gene was inserted into pYES2 and transformed into yeast cells. The MnSOD protein was successfully expressed in yeast by SDS-PAGE analysis. High concentration of salt stress tests indicated that expression of Mn-SOD gene in yeast could significantly improve the salt tolerance of yeast strain INVScⅠ.

Key words Ceriops tagal； Salt tolerance； Mn-SOD； Yeast

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.014

正常生長條件下，植物體內活性氧產量較低，并且處于一種相對平衡狀態，當環境條件發生改變時，這種動態平衡被打破，活性氧大量生成[1]。活性氧的大量爆發會導致核酸的損傷、蛋白質氧化、脂質過氧化，從而引起許多細胞喪失功能[2]。在長期進化過程中，植物細胞往往會進化出先進的防御系統對抗活性氧，包括酶促和非酶促系統[3]。超氧化物歧化酶（SODs）是細胞對活性氧防御體系的第一道防線；這些酶迅速將超氧陰離子（O2·- ）和水（H2O）轉換為過氧化氫（H2O2）和分子氧（O2）[4-5]。

大多數植物含有一系列的超氧化物歧化酶同功酶。根據金屬輔因子的不同，超氧化物歧化酶分為3種類型：鐵離子超氧化物歧化酶（Fe-SOD），錳離子超氧化物歧化酶（Mn-SOD），以及銅-鋅超氧化物歧化酶（Cu/ ZnSOD），分別位于細胞不同組分中。有研究結果表明，細胞受到有害輻射、氧化還原試劑、病毒感染、逆境脅迫等傷害時，Mn-SOD含量及酶活性會明顯增高，起到保護DNA、降低細胞癌變機率的作用；過量表達Mn-SOD可以使植株在受到氧化脅迫時提高其抗逆性[6]。

角果木屬于紅樹科角果木屬典型的非泌鹽性紅樹植物，具有很強的耐鹽性[7]。在長期的進化中形成了自己獨特的耐鹽機制，當受到鹽脅迫時，其體內超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等抗氧化酶類活性大大增加，且這些酶類的活性與受到鹽脅迫的程度呈正相關性[7]。目前已經有相關研究結果表明，將檉柳Mn-SOD轉入酵母INVSc I中可以提高酵母的抗鹽、抗干旱、抗高溫能力[8-9]。本課題組前期采用數字表達譜技術對鹽脅迫下角果木根系差異表達基因進行了篩選，發現Mn-SOD受到鹽脅迫時表達量顯著增加（待發表數據）。為進一步研究該基因的耐鹽功能，本研究分離了Mn-SOD的全長cDNA序列，并轉入酵母中過表達后進行酵母耐鹽性功能驗證，酵母作為最常用的的真核表達載體，相對于原核表達載體大腸桿菌，具有對表達的目的蛋白進行翻譯后修飾的功能，比如信號肽的剪切、糖基化等，對于基因的功能研究更有意義。本研究在酵母中探索了Mn-SOD的耐鹽性，為進一步闡明抗氧化系統在鹽生植物耐鹽中所發揮的作用及機理奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

角果木成熟胎生苗采自海南省東寨港紅樹林保護區。選擇無病蟲害，發育良好，形態大小且成熟度相似的胎生苗，在Hoagland營養液[10]中培育至幼苗長出第二對葉，在500 mmol/L NaCl溶液中分別處理1、3、6、9、12、24 h，取根，加液氮充分研磨成粉末，-80 ℃保存，用于RNA提取。

1.2 方法

1.2.3 酵母表達載體構建 根據引物末端添加的酶切位點，Xba I和Kpn I雙酶切TA克隆，回收Mn-SOD基因片段；同樣的酶組合酶切酵母表達載體pYES2，回收載體大片段，按外源片段分子末端：載體片段分子末端=3 ： 1的比例進行連接；連接產物熱激法轉化大腸桿菌DH5α，重組菌落經PCR和酶切檢測，陽性克隆命名為pYES2/MnSOD。

重組質粒pYES2/MnSOD采用PEG介導的轉化法導入缺陷型酵母表達菌株INVSc I，在尿嘧啶缺失的固體合成培養基（SC-Ura）上，30 ℃倒置培養至長出單克隆菌落，進行菌落PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 目的蛋白誘導表達檢測 取鑒定后的重組酵母菌單克隆于SC-Ura液體培養基中，200 r/min，30 ℃過夜培養至菌液濃度為OD600=0.5，按照1 ∶ 500比例稀釋于SC-Ura液體誘導培養基中（用2%半乳糖替代碳源葡萄糖），誘導培養20 h，取1.5 mL濃度為OD600=2.5的菌液于離心管中，8 000 r/min 離心5 min，收集菌體，100 μL ddH2O重懸菌體，再加入100 μL 0.2 mol/L NaOH溶液裂解細胞5 min，收集上清即為蛋白抽提液。經SDS-PAGE膠分離后考馬斯亮藍染色，拍照分析。

1.2.5 重組酵母菌的鹽脅迫處理 酵母菌INVSc I（pYES2）和酵母菌INVSc I（pYES2/MnSOD）分別用SC-Ura液體培養基+1 mol/L NaCl溶液和SC-Ura液體培養基+3 mol/L NaCl溶液30 ℃培養72 h，以SC-Ura液體培養基+ddH2O作為對照。取等體積菌液稀釋105倍后接種在SC-U固體培養基上，30 ℃培養，對平板上酵母菌INVSc I（pYES2）和INVSc I（pYES2/MnSOD）的鹽脅迫后生長情況進行計數。

2 結果與分析

2.1 根部總RNA提取結果

角果木根部總RNA 甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖1所示。提取0～24 h內7個時間點的RNA，其均有明顯的18 S和28 S RNA條帶，且帶形完整，無明顯的擴散現象，表明所分離的RNA無污染，質量符合后續研究要求。

2.2 Mn-SOD基因的分離及分析

以反轉錄獲得的第一鏈cDNA為模板，含有Xba I和Kpn I酶切位點的引物進行PCR擴增，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，擴增條帶位于750 bp左右，與預期大小一致（圖2）。

陽性重組克隆測序（圖3）結果表明，所擴增條帶大小為799 bp，其中CDs序列全長717 bp，與角果木轉錄組測序結果100%一致。GeneScan軟件分析表明，該基因編碼238個氨基酸殘基，其中35～115位氨基酸為Fe/Mn-SOD家族的α發卡結構域，125～230位氨基酸殘基為Fe/Mn-SOD家族的C端保守結構域，該蛋白等電點為 6.79，蛋白質分子量為26.4 ku。

利用推測的氨基酸序列進行同源性分析顯示，所搜索到的100條序列均為Mn-SOD基因的氨基酸序列，同源性位于68%～77%之間，其中同源性最高（77%）的為橡膠Mn-SOD基因（登錄號：P35017）編碼的氨基酸序列。應用ClustalW2軟件對同源性較高的前10個序列進行多重比較和進化分析，結果表明，本研究分離的Mn-SOD單獨成一個分枝，與同源性最高的橡膠Mn-SOD距離較遠，卻與同源性較低的PRUPE較近（圖4）。

2.3 酵母表達載體構建

Mn-SOD基因片段和酵母菌載體pYES2雙酶切后相連得到重組質粒，該重組子經過PCR鑒定后進行雙酶切鑒定，1%的瓊脂糖凝膠結果表明，酶切獲得729 bp的條帶，與預期大小一致（圖5）。證明Mn-SOD基因已經成功連入pYES2載體，該重組質粒命名為pYES2/MnSOD（圖6）。

2.4 重組質粒酵母轉化的鑒定

PEG介導的轉化法將重組質粒轉入酵母菌INVScⅠ中，在SC-Ura培養基上直至長出單克隆菌落。菌落PCR檢測，產物1%瓊脂糖凝膠電泳結果見圖7。從圖7可以看出，pYES2/MnSOD轉化后長出的酵母均能擴增出預期大小的條帶，編號為4的酵母擴增條帶最亮，因而挑選4號酵母作為下一步研究的試驗材料。

2.5 目的蛋白誘導表達檢測

為檢測Mn-SOD基因在酵母菌INVScⅠ中的表達情況，本研究提取了轉入重組質粒和空載體的酵母菌INVSc I蛋白抽提液，SDS-PAGE電泳結果顯示，含有重組質粒的酵母菌落蛋白提取液中有一條明顯的蛋白帶，而攜帶空載體的酵母菌INVScⅠ中缺乏該條帶，該條帶位于25～35 ku之間，表明Mn-SOD在酵母細胞中能有效表達特征條帶（圖8）。

2.6 重組酵母菌的耐鹽性分析

菌落計數結果表明，這兩種酵母都能夠生長，但重組酵母菌的生長情況明顯好于轉入空載體的酵母菌，鹽脅迫濃度越高，兩者差異越明顯（圖9）。

進一步對培養基上生長的酵母菌落進行計數分析，結果表明，鹽脅迫抑制了酵母菌的生長，隨著鹽濃度的增加，抑制作用逐漸增強，未處理時，空載體和轉入Mn-SOD基因的酵母菌落數差異不顯著，處理6 h和24 h后，INVScⅠ（pYES2/MnSOD）菌落數量均極顯著高于轉入空載體的酵母菌INVScⅠ（pYES2）（p<0.1）（圖10），這表明在相同鹽脅迫條件下，外源Mn-SOD基因的表達提高了酵母菌INVScⅠ（pYES2/MnSOD）的耐鹽性。

3 討論與結論

植物對鹽脅迫的耐受反應是近年來植物領域研究的一個重點，隨著各種研究手段的不斷發展，積累了越來越多的鹽脅迫應答資料，目前公認的植物應答鹽脅迫的生理機制包括形態適應性、離子平衡、滲透調節和活性氧的清除，其中活性氧清除機制更是普遍存在于鹽生植物和非鹽生植物中。植物在高鹽環境下體內活性氧爆發造成動態失衡，進而對細胞的生物膜系統造成傷害[12-13]。為減輕這種傷害，植物在長期的進化過程中，形成了活性氧清除機制，包括非酶類抗氧化保護系統和酶類抗氧化保護系統兩大類。而酶類抗氧化保護系統又包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）等[14]，其中超氧化物歧化酶（SOD）是第一個參與的酶類，能將超氧陰離子歧化為H2O2和O2，在酶類抗氧化保護系統占主要位置[15]。目前SOD基因的功能驗證研究主要還是導入植物進行遺傳轉化，馬淑娟等將Cu/Zn-SOD轉入煙草使其耐衰老能力和抗氧化能力都增強[16]。覃鵬等[17]研究發現，外源Mn-SOD基因的導入能提高煙草抗旱能力，而Fe-SOD基因的導入雖能提高煙草體內的SOD活性水平，但不能提高煙草的抗旱性。可見，SOD基因的研究具有廣闊的研究前景和研究價值。本文對紅樹角果木在高鹽逆境脅迫下的Mn-SOD進行功能解析，表明SOD基因與植物的多種逆境相關，不僅從一個側面闡述了角果木抗逆性極強的緣由，更清晰地表明，來自角果木的Mn-SOD與植物的耐鹽度成正相關。

生長在海岸潮間帶的紅樹植物-角果木，作為一種典型的非泌鹽性真紅樹植物，在長期的自然選擇下形成了一套有效的活性氧清除機制。本實驗室前期對比了鹽脅迫下角果木離子平衡、抗氧化脅迫等相關生理指標的差異[7]，結果表明，脅迫早期抗氧化相關的SOD、POD等酶活性顯著上升，MDA的變化不明顯；并采用轉錄組和數字表達譜技術進行差異基因的篩選，候選SOD等基因。為進一步明確抗氧化保護系統在紅樹植物耐鹽中發揮的作用，本研究采用RT-PCR方法分離了Mn-SOD基因，并在酵母中進行功能驗證，結果表明，Mn-SOD基因的過表達能顯著提高酵母的耐鹽性，這與Takemura等的研究結果一致[18]，意味著通過調控抗氧化酶的表達有可能獲得耐鹽性提高的轉基因植物，這為開展熱帶作物抗逆育種提供了試驗依據。但在紅樹植物中耐鹽性的產生是抗氧化系統發揮主要作用還是其他生理機制發揮主要作用還有待進一步研究。

參考文獻

[1] 丁義峰， 靳 萍， 劉 萍. 植物SOD的基因表達活性調節及抗逆作用研究進展[J]. 生物學教學， 2012， 37： 6-7.

[2] Polle A. Dissecting the superoxide dismutase-ascorbate-glutathione pathway in chloroplasts by metabolic modeling. Computer simulations as a step towards flux analysis[J]. Plant Physiol， 2001， 126： 445-462.

[3] Alscher R G， Erturk N， Heath L S. Role of superoxide dismutases（SODs）in controlling oxidative stress in plants[J]. J Exp Bot， 2002， 53： 1 331-1 341.

[4] Bowler C， van Camp W， van Montagu M， et al. Superoxide dismutases in plants[J]. Crit. Rev. Plant Sci， 1994， 13： 199-218.

[5] Bowler C， van Montagu M， Inze′ D. Superoxide dismutase andstresstolerance[J]. Annu Rev PlantPhysiol PlantMol Biol， 1992， 43： 83-116.

[6] 魏宗波， 苗向陽， 楊鳴琦， 等. MnSOD基因表達調控的研究進展[J]. 遺傳， 2008， 30（7）： 831-837.

[7] 符秀梅. 鹽脅迫下紅樹植物-角果木耐鹽生理及分子基礎研究[D]. 海南大學， 2011.

[8] 常萬霞. MnSOD基因的克隆及功能驗證[D]. 哈爾曼東北林業大學， 2006.

[9] 廖 巖， 陳桂珠. 鹽度對紅樹植物影響研究[J]. 濕地科學， 2007， 5（3）： 266-273.

[10] BenavidesM P， Marconi P L， Gallego S M， et al. Relationship between antioxidant defense systems and salt tolerance in Solanum tuberosum[J]. Aust Plant Physio， 2000， 27： 273-278.

[11] Hernandez J， Jimenez A， Mullineaux P， et al. Tolerance of pea plants（Pisum sativum）to long term salt stress is associated with induction of antioxidant defenses[J]. Plant Cell Environ， 2000（23）： 853-862.

[12] Mittova V， Tal M， Volokita M， et al. Up-regulation of the leaf mitochondrial and peroxisomal antioxidative systems in response to salt induced oxidative stress in the wild salt-tolerant tomato species Lycopersicon pennellii[J]. Plant Cell Environ， 2003， 26： 845-856.

[13] Hoagland D R， Arnon D I. The water-culture method for growing plants without soil[J]. Circular California Agricultural Experiment Station（No. 2nd edit）， 1950， 347： 32.

[14] 夏鐵騎.自由基、活性氧、 SOD及植物衰老機理研究的現狀與進展[J]. 濮陽職業技術學院學報， 2005， 5（2）： 23-24.

[15] 馬旭俊， 朱大海. 植物超氧化物歧化酶（SOD）的研究進展[J]. 遺傳， 2003， 25（2）： 225-231.

[16] 馬淑娟， 喻樹迅， 范術麗， 等. 轉棉花葉綠體Cu/Zn.SOD基因煙草的獲得及其功能的初步驗證[J]. 分子植物育種， 2007， 5（3）： 319-323.

[17] 覃 鵬， 劉飛虎， 孔治有. 等.轉SOD基因對煙草抗旱性和相關生理指標的影響[J]. 廣西植物， 2006， 26（6）： 621-625.

[18] Takemura T， Hanagata N， Dubinsky Z， et al. Molecular characterization and response to salt stress of mRNAs encoding cytosolic Cu/Zn superoxide dismutase and catalase from Bruguiera gymnorrhiza[J]. Trees-Struct Funct ， 2002， 16： 94-99.