土壤中金黃色葡萄球菌分離實驗改進

摘 要：目的：從土壤中分離金黃色葡萄球菌。方法：選擇性培養基平板涂布分離法。結果：分離到的菌株經菌落鑒定、革蘭氏染色和形態鑒定以及金黃色葡萄球菌測試卡鑒定，都符合金黃色葡萄球菌特征。結論：所采用從土壤中分離微生物的方法快速，簡便，可靠，可在教學中推廣應用。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌； 分離； 實驗改進

中圖分類號：R378.11 文獻標識碼：A 文章編號：1006-3315（2014）10-165-001

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）廣泛分布于自然界，土壤、空氣、水體、塵埃、人和動物的身體表面都可找到。因而由它引起食品污染的機會很多。可以引起人和動物的感染。在人體主要寄殖于鼻前庭黏膜、腹股溝、會陰部和新生兒臍帶殘端等部位，偶爾也寄生于口咽部、皮膚、腸道及陰道口等，是醫院感染常見的病原體之一。金黃色葡萄球菌腸毒素是世界性衛生難題，在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，占整個細菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占到45%，我國每年發生的此類中毒事件也非常多[1]。近年來，美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌[2]。

金黃色葡萄球菌在平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑一般為1～2mm。血平板菌落周圍形成透明的溶血環。典型的金黃色葡萄球菌個體形態為球型，直徑為0.5～1μm，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌無芽胞、無鞭毛，大多數無莢膜，革蘭氏染色陽性。它對營養要求不高，在普通牛肉膏培養基上生長良好，需氧或兼性厭氧，最適宜生長溫度37℃，最適宜生長pH7.4，干燥環境下可存活數周。金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可以在10%～15%NaCl肉湯中生長。對磺胺類藥物敏感性低，但對青霉素、紅霉素等高度敏感。對堿性染料敏感，十萬分之一的龍膽紫液即可抑制其生長。為控制金黃色葡萄球菌對人類的危害以及在生物教學中常常要分離其菌株對其進行研究。傳統的分離方法需要對菌落多次純化，實驗麻煩。因而探索快速可靠的分離方法，獲得金黃色葡萄球菌在實際工作中有積極意義。

一、材料

（一）培養基

牛肉膏蛋白胨培養基（13%NaCl）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉130g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min后倒平板。

（二）試劑

復方磺胺甲惡唑，革蘭氏染液，甲苯胺蘭-DNA，金黃色葡萄球菌測試卡（廣州綠洲生化科技股份有限公司出品）。

二、方法

（一）金黃色葡萄球菌的分離

稱取10g土樣，在無菌條件下放入滅菌的三角瓶中，加入90mL蒸餾水，再加入0.2mg復方磺胺甲惡唑振蕩10min，使土樣充分混勻，利用金黃色葡萄球菌對磺胺類藥物敏感性低的特性，殺死其它細菌。從三角瓶中取1mL上清液放入一支無菌試管（15×150mm）中，按10倍梯度稀釋法稀釋成10-5的土壤稀釋液后，分別取200μL涂布于牛肉膏蛋白胨高鹽培養基平板上，置于37℃培養箱中恒溫培養24h。利用高鹽培養基抑制其它細菌的生長，從而分離得到金黃色葡萄球菌。

（二）金黃色葡萄球菌的鑒定

1.菌落形態。菌落較小，圓形、直徑1～2㎜，較濕，較透明，邊緣整齊，隆起，略帶淡綠色。

2.染色觀察：從平板上挑取可疑性菌落進行革蘭氏染色，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性，顯微鏡下呈單個或葡萄狀排列、無芽孢、莢膜，單個菌體直徑為0.5～1μm。

3.金黃色葡萄球菌快速測試片鑒定。該測試片含有選擇性培養基（改良的Baird-Parker營養物及冷水可溶的膠體）和專一性的酶顯色劑，即熱穩定核酸酶（Tnase）反應片，包含有甲苯胺藍（toluidineblue-O） -DNA及四唑指示劑（tetrazolium），此指示劑有助于菌落的計數及確定葡萄球菌熱穩定核酸酶的存在。使用該測試片培養15～24h就可確認是否有金黃色葡萄球菌的存在。操作方法按測試片使用說明書進行。

（1）樣品處理。用無菌接種環取待測菌落一個放入含有2mL無菌水的試管中，適當振蕩均勻，制成樣品液（記錄菌落特征并編號）。

（2）接種。將金黃色葡萄球菌快速測試片置于平坦實驗臺面，揭開上層膜，用無菌注射器或吸管吸取1mL樣品液慢慢均勻地滴加到金黃色葡萄球菌快速檢測片上，然后再將上層膜緩慢蓋下，靜置5min，使培養基凝固，最后用手輕輕地壓一下。

（3）培養及結果判定。將測試片疊在一起放回原自封袋中并封口，透明面朝上水平置于恒溫培養箱內，堆疊片數不超過12片。37℃，培養15～24h，觀察結果。測試片上紫紅色的菌落為金黃色葡萄球菌。

（4）注意事項。

①在環境溫度20～30℃下操作；檢測卡極易受潮，打開小包裝后應立即使用。②所有跟待檢樣品接觸的器具都應滅菌，或一次性滅菌器具。③樣品勻液的pH值應在6.5～7.5之間，必要時用1mol/LNaOH或1mol/L HCl調節pH。

三、小結與討論

利用金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，對磺胺類藥物有敏感性低的特性，制備選擇性培養基，采用平板涂布法分離到的菌株，經菌落特征鑒定、革蘭氏染色顯微鏡形態觀察鑒定以及金黃色葡萄球菌測試卡鑒定，都符合金黃色葡萄球菌特征。所采用從土壤中分離金黃色葡萄球菌的方法快速，簡便，可靠，可在教學和實際工作中推廣應用。

基金項目：貴州省高校專業綜合改革試點項目：黔教高發[2012]426號；黔南民族師范學院微生物學重點學科建設項目：院政發[2011]04號；黔南民族師范學院優秀教學團隊建設項目，院教發{2011}5號。

參考文獻：

[1]劉旭偉，葛文霞.金色葡萄球菌腸毒素[J]微生物學雜志，2008，28（5）：86～89

[2]高濤.食品中金黃色葡萄球菌腸毒素及檢測方法的研究進展[J]福建分析測試，2003，12（2）：1775～1778