HPLC測定固腎定喘丸中丹皮酚的含量

摘要：目的： 通過測定固腎定喘丸中丹皮酚的含量對其質量進行控制； 方法： 采用高效液相色譜法（HighPerformanceLiquidChromatography，HPL-C），選用XDBC-18076331柱（250mm×4.6mm，10μm，），甲醇-水（45：55）為流動相；柱溫：25℃，流速為1.0ml·min-1；測定波長為274nm；進樣量：10μL。 結果： 丹皮酚在4.312-107.800μg范圍內線性關系良好（A=203.29X+2.74，r=1.0000），平均回收率為99.06%，RSD=0.28%； 結論： 該方法簡便、靈敏、準確，可用于固腎定喘丸的質量控制。

關鍵詞： HPLC；固腎定喘丸；丹皮酚

【中圖分類號】R286.0 【文獻標識碼】A 【文章編號】1002-3763（2014）04-0059-01

1.儀器與試藥

Agilent1200全自動高效液相色譜儀，Agilent1200系列四元泵，AgilentG1314BVWD1200系列可變波長紫外檢測器，Agilent1200化學工作站；KQ-電子分析天平（瑞士METTLERTOLEDO，型號：XS105）。KQ-600DE型數控超聲波清洗器甲醇為分析純；水為去離子水。對照品：丹皮酚對照品 固腎定喘丸由廣州白云山敬修堂藥業股份有限公司提供

2.方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱為Hypersil-C18柱（250mm×4.6mm，10μm，特），甲醇-水（45：55）為流動相，流速為1.0ml·min-1，檢測波長274nm，柱溫為室溫。理論塔板數應不低于5000，此條件下待測組分與其它組分達到有效分離。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備

精密稱取丹皮酚對照品1mg，置于50ml的容量瓶中，加入甲醇至刻度，作為貯備液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備

精密量取本品0.5g，置于50mL燒瓶里，精確加入甲醇25，用天平稱出重量，利用超聲波處理30min，放冷，再確定重量，根據溶液的減少量補足甲醇，再搖勻，過濾，取續濾液，即可配制出供試品溶液。

2.2.3陰性對照溶液的制備

陰性對照溶液的制備是按照中藥的處方中各種中藥的味數的比例確定的，按其工藝，制成不含牡丹皮的空白制劑，制備方法和供試品溶液的制備方法相同。

2.3方法學考察

2.3.1線性范圍考察

精密吸取丹皮酚2、4、6、8、10、12μl的對照品溶液進行色譜測定，按“2.1”項所述色譜條件分別測定峰面積。按照橫坐標為進樣量X（μl），縱坐標為峰面積（mAUS）的參數繪制標準曲線，得出回歸方程。丹皮酚的回歸方程是：A=203.29X+2.74，相關系數r=1.0000。丹皮酚在4.312-107.800μg范圍內有良好線性關系。

2.3.2精密度試驗

精密吸取（20.58μg.ml-1）10μl的丹皮酚對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下重復進樣6次，測得連翹苷峰面積的平均值為2006.1，RSD為0.69%。

2.3.3穩定性試驗

取同一供試品溶液分別于0、2、4、8、24h進樣10μl，測定峰面積的平均值為446.3，RSD為0.3%，其結果顯示丹皮酚24h內穩定性良好。

2.3.4重復性試驗

取同一批號（批號：L01003）固腎定喘丸按供試品溶液制備方法制備5

份供試樣品，每份測定2次，測得丹皮酚的平均含量為103.60μg.ml-1，RSD為1.1%。

2.3.5回收率試驗

精密吸取已知含量的固腎定喘丸樣品（批號：L01003）1ml，分別精密加入10ml丹皮酚對照品貯備液，按供試品溶液制備方法制成加樣供試品溶液，吸取加樣供試品溶液10μl注入液相色譜儀。按上述方法測定加樣供試品溶液中丹皮酚的含量平行操作6份，按“2.1”項色譜條件測定含量，分別計算回收率。2.4樣品測定

精密量取丹皮酚對照溶液10μl，供試品溶液10μl分別注入液相色譜儀中，按“2.1”項下色譜條件，計算丹皮酚含量。

3.討論

3.1有效成分

丹皮酚是中藥牡丹皮的有效成分，而且含量較高，故以其為指標，測定其在制劑中的含量，以此來控制固腎定喘丸的質量。

3.2波長的選擇

最佳檢測波長的選擇經查閱文獻，丹皮酚對照品溶液在274nm波長處有最大吸收，中國藥典2010年版一部牡丹皮含量測定選用274nm作為檢測波長[1]，因此實驗選擇274

nm作為檢測波長。

3.3流動相的選擇

通過查閱文獻[2-10]，發現曾有人采用：乙腈-1%冰乙酸系統、乙腈-水系統、甲醇-乙酸-水系統，通過參照文獻和實驗結果的基礎上，發現發現采用甲醇-水（45：55）時，丹皮酚峰形對稱，分離完全，雜質干擾少，基線平直，故采用甲醇-水（45：55）作為流動相。

3.4提取方法

牡丹皮超聲提取時間的選擇本文選用超聲方法提取牡丹皮中丹皮酚，方法簡便易行，經比較不同超聲提取時間結果表明超聲振蕩30min，丹皮酚己基本提盡。

3.5峰形

在實驗過程中，發現有的峰形不是很好，比如出現肩峰、峰拖尾或出現基線噪聲，分析其各自原因及各自的解決方法：（1）出現肩峰可能的原因及解決方法有：①柱塌陷或形成短路通道：更換色譜柱，采用較弱腐蝕性條件；②柱內燒結不銹鋼失效：更換燒結不銹鋼。（2）出現峰拖尾可能的原因及解決方法有：①峰干擾：清潔樣品，調整流動相；②硅羥基作用：加三乙胺，用堿致鈍化柱，增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相pH值，鈍化樣品；③柱效下降：用較低腐蝕條件，更換柱，采用保護柱。（3）出現基線噪聲的原因及解決方法有：①氣泡：流動相脫氣，加柱后背壓；②.污染：清洗柱，凈化樣品，用HPLC級試劑。

結束語

由于中藥成分比較復雜，使用高效液相色譜分析法作為其質量控制的主要方法，這種測量方法分離效果好，分析速度快，靈敏度高，操作自動化，是對中藥進行成分分析的一種極有價值的分析技術。實驗中也可以體驗到方法的優勢。采用高效液相色譜法，可以為固腎定喘丸的質量控制提供了快速、準確的測定方法。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會，中華人民共和國藥典[S].一部，北京：化學工業出版社，2010：160-161

[2]賈瑞艷，劉影.HPLC法測定六味地黃丸（濃縮丸）中丹皮酚的含量[J].黑龍江醫藥，2009，22（2）：120-122

[3]寇婉青，開偉華，王蓉，等.HPLC法測定桂枝茯苓丸中丹皮酚的含量[J].安徽醫藥，2009，13（5）：508-509