HCV的分型方法和基因分型的意義

摘要：

丙型肝炎病毒（HCV）是引起丙型肝炎的病原體。HCV感染是一個世界性的健康問題，其發病率逐年增高，且致病性強，較易轉為墁性，甚至發展成肝硬化和肝細胞癌。進一步深入HCV生物學特性，尤其是基因分型的研究，對于丙型肝炎嚴重程度的評估；抗病毒藥物敏感性的預測；提高診斷準確率以及疫苗研制和傳播的地域分布特征的認識均有較大意義。

關鍵詞：丙型肝炎病毒；基因分型；意義

【中圖分類號】

R322.4+7 【文獻標識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）08-0025-01

丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）是引起丙型肝炎的病原體，最初于1975年在一名輸血后的患者血清中被發現，當時命名為非A非B型肝炎病毒（Non-A Non-B Hepatitis，NANBH）^[1]。隨著分子生物學的發展，Michael Houghton的團隊在1989年首次克隆其基因組^[2]。同年Alter HJ等人在NANBH患者體內發現并分析了其抗體^[3]，其隨后旋即被命名為HCV。HCV感染是一個世界性的健康問題^[4]，其發病率逐年增高，且致病性強，較易轉為慢性，導致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，并可發展為肝硬化和肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）。HCV主要由血液系統傳播，據估計全球的HCV感染率約為3.0%，即大約有1.7億人被感染，每年新發病例約3.5萬例^[6]。在我國，HCV的感染率約在2.5%～4.9%之間，有超過5000萬人感染HCV。HCV感染者初期大多數無明顯癥狀，大約有70%～80%的HCV急性感染會轉為慢性感染，其中約有10%～20%的慢性感染者會轉變成肝硬化，最終約有5%的慢性感染者進展為HCC^[7]。

深入研究HCV基因分型，對于反映丙型肝炎疾病的嚴重程度；抗病毒藥物敏感性的預測；輔助提高丙型肝炎的診斷準確率；以及HCV疫苗的研究和了解HCV傳播的地域分布特征均有較大意義。

1 HCV分型方法

1.1 全基因組直接測序分析法：此方法是目前HCV基因分型方法中最經典、最準確的方法。該方法采用比較特異性多PCR引物擴增特定的核苷酸序列區域，直接測序后與GenBank中己上傳的HCV序列進行比對后，描繪出系統進化樹，根據進化距離及種系關系確定HCV的基因型。直接測序法可以最大程度的獲得HCV的序列信息，結果最為可靠，是HCV基因分型的“金標準”。但此法耗時、費力且昂貴，并不適合所有的實驗室使用。

1.2 型特異性引物擴增法（PCR Amplification with Sequence Specific Primers，PCR-SSP）：根據HCV不同基因型在某一特定區段（主要是C區和NS5B區）堿基序列上的差異，設計一系列型特異性引物，不同HCV基因型可通過PCR擴增出長度大小不同的片段，并以此分型。因為該方法相對簡便易操作，曾是國內外學者較早普遍使用的方法。其中最先應用的Okamoto法是日本學者Okamoto根據C區的基因序列變化的規律性與HCV基因型的關系建立的。該方法的主要缺點是必須要保證HCV各型之間有較大差異，且對PCR引物的設計要求較高，每份樣品需同時進行多次檢測才能最終確定基因型，所以其準確性及靈敏度都較低。雖然該方法經改進后靈敏度及準確性都有所提高，但與相對于其他分型方法，分型的效果仍較差。因此未能在臨床及科研中廣泛應用。

1.3 限制性片段長度多態性分析法（Restrietion Fragment Length polymer- phism，RELP）：根據HCV不同基因型在某一區段個別核苷酸序列的變異直接導致某些酶切位點的改變，PCR擴增靶基因后，用多種特定的種限制性內切酶對PCR產物進行酶切，不同的基因型或亞型就可以得到長度大小不同的酶切片段。然后，根據酶切后電泳所表現的片段大小及多態性進行HCV基因分型。一般選擇5’UTR或NS5B區域作為RELP分型的靶區域。該方法具有快速、經濟等優點，但其缺點是僅用少數幾個內切酶，檢測基因型別有限，最重要的是不能發現新的基因型。

1.4 型特異性核酸探針雜交法（PCR Sequence Specific Oligonueleotide，PCR-SSO）：根據各型HCV某一區段的序列差異分別設計特異探針并固定在纖維素膜或芯片上，通過生物素或者其它類型的標記物標記引物，利用RT-PCR擴增HCV基因片段，將擴增產物與膜上特異性探針雜交，經顯色反應后，檢測HCV基因型。目前國內外廣泛使用的線性探針雜交（Line Probe Assay，LiPA）就是型特異性核酸探針雜交分型方法。該方法操作比較簡便，而且改良后的LiPA-II對HCV 1a、lb亞型及東南亞地區的6型的鑒別有較好的特異性。但是，該方法價格昂貴，不適宜所有的實驗室廣泛推廣。

HCV RNA基因組由多個區段組成，選擇哪個區段作為分型依據成為關鍵問題。5’UTR區域的序列是整個HCV基因組中最為保守的部分，種系間變化的程度及進化頻率都很低，可用于區分主要基因型。現今市面上幾乎所有商品化的HCV基因分型試劑盒，如LiPA、TRUGENE、Invader、Abbott等都是基于此區域設計的。但在我國西南地區及東南亞，部分6型和la、lb亞型在該區域序列幾乎完全一致，所以還需要配合其它區域序列分析進行詳細區分。NS5B區和C/El區進化變異較大，屬于HCV的亞基因區及種屬信息區，富含區分HCV基因型及亞型的序列信息。1993年，Simmond等選擇NS5B作為主分型區域，利用核苷酸序列測序及系統進化分析，最終確立為國際通用的HCV分型命名，即將HCV分為6種主要基因型及一系列亞型。但是，由于種屬信息區序列具有較高的異質性，由于引物結合失敗而導致的PCR擴增失敗的幾率也隨之增加。因此，聯合兩個以上的區域如5’UTR與C區、El與NSSB區或El與C區對HCV基因進行分型，則可使分析結果更加可信和真實。雖然測定部分區域也可以進行HCV分型，但是測定全基因組序列才是最可靠的方法。

2 HCV基因分型的意義

2.1 反映疾病的嚴重程度：

血清HCV RNA水平與肝臟的炎癥活動有明顯相關性。HCV RNA載量變化反映了病毒復制的活躍程度和病情的進展情況。HCV基因型與HCV RNA含量有著明顯的相關性，HCV基因1、2型感染者血清中HCV RNA含量顯著高于HCV基因3型感染者，且病毒復制活躍，病情較易轉為慢性化。不同的HCV基因型所致疾病的嚴重程度也有所不同，某些基因型可能會引起較嚴重的肝細胞損傷。血清轉氨酶檢測是一項評估肝病活動性的有效的生化指標。HCV基因型2感染和HCV基因2/3混合型感染很可能導致血清轉氨酶異常升高。

2.2 抗病毒藥物敏感性預測指標：

α干擾素（IFN-α）是丙型肝炎抗病毒治療的首選藥物，在其臨床應用過程中，研究發現IFN-α的臨床療效與HCV基因型有密切關系，病毒基因型可以作為預測α干擾素治療丙型肝炎臨床療效的重要指標。一般認為，1b型感染者血清中病毒含量高、病毒復制活躍，對干擾素反應差，臨床療效低于2a、2b和3型。現今，多數學者認為干擾素對HCV基因3型療效較HCV基因2型好。已有的研究表明HCV基因型1、4、5、6和2、3對α干擾素聯合利巴韋林治療的持續病毒學應答（SVR）分別為30%和65%，感染1b亞型的患者對干擾素治療效果最差。這可能是由于NS5A區域內ISDR基因突變，引起干擾素誘導的細胞抗病毒關鍵通路PKR途徑變化所致。

2.3 輔助提高丙型肝炎的診斷準確率：

目前臨床上普遍使用的第三代抗體檢測HCV方法，抗原幾乎都來自la亞型重組蛋白，HCV la亞型感染者的血清抗體效價明顯高于其他基因型或者亞型感染者。但是不同基因型的HCV核苷酸序列之間的有比較大的差異，因此所表達出蛋白的免疫原性和抗原性也有所區別。為了提高對HCV感染的檢測靈敏度，應根據本地區的HCV流行特點來選擇診斷試劑和方法，以提高診斷敏感性和特異性。應該選擇不同基因型的最保守區域作為檢測靶位點，以保證最大限度的檢出病毒，避免出現假陰性結果，為臨床輸血的安全性提供可靠保障。

2.4有助于HCV疫苗的研究：

預防丙型肝炎的最有效的措施應該是HCV疫苗。但是由于HCV基因的突變率非常高，導致其抗原性變異較大。因此，有效的HCV疫苗應包含大部分主要基因型的抗原表位，或根據該地HCV基因型分布特點來制備相應的預防性疫苗。

2.5 有助于了解HCV傳播的地域分布特征：

HCV感染呈現全球分布，但是不同地區的HCV基因型分布卻存在著較大的差異，這種差異可能是由于地域或者人群的不同造成HCV的進化和親緣關系、HCV宿主間的免疫應答機制的不同造成的。目前非洲大陸及東南亞地區是世界上檢測到HCV基因亞型最多的地區，根據系統進化理論分析認為，二三百年來HCV在各大洲間的傳播很頻繁，但是現在卻很難確定6種HCV基因型的共同祖先、其特定的起源地理位置。另外，HCV基因分型的研究還有助于了解HCV總體的變異趨勢和判斷HCV的傳播途徑，對于預防和控制HCV感染也具有重要現實意義。

參考文獻

[1]Feinstone SM， Kapikian AZ， Holland PV， et al. Transfusion-associated hepatitis not due to viral hepatitis type A or B. N Engl J Med. 1975； 292（15）： 767-770.

[2]Choo QL， Kuo G， Houghton M， et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A，non-B viral hepatitis genome. Science. 1989； 244（4902）： 359-362.

[3]Kuo G， Choo QL， Stevens CE， et al. An assay for circulating antibodies to a major etiologic virus of human non-A， non-B hepatitis. Science. 1989； 244（4902）： 362-364.

[4]Levrero M. Viral hepatitis and liver cancer： the case of hepatitis C. Oncogene. 2006； 25（27）： 3834-3847.

[5]Altekruse SF， McGlynn KA and Reichman ME. Hepatocellular carcinoma incidence， mortality，and survival trends in the United States from 1975 to 2005. J Clin Oncol. 2009； 27（9）： 1485-1491.

[6]Global surveillance and control of hepatitis C. Report of a WHO Consultation organized in collaboration with the Viral Hepatitis Prevention Board， Antwerp， Belgium. J Viral Hepat. 1999； 6（1）： 35-47.

[7]Hoofnagle JH. Course and outcome of hepatitis C. Hepatology. 2002； 36（5 Suppl 1）： S21-S29.