成牙骨質細胞的研究進展

摘要：由成牙骨質細胞形成的牙骨質在牙周組織的發(fā)生、發(fā)育和再生中起著非常重要的作用，目前學者主要集中于對成牙骨質細胞的研究上，本文就成牙骨質細胞的來源和分化、分子生物學特征、礦化相關蛋白對成牙骨質細胞增殖分化的影響作一綜述。

關鍵詞：成牙骨質細胞；來源；分子生物學特征；礦化相關蛋白

【中圖分類號】

R249 【文獻標識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）07-0032-02

牙周病是口腔內常見的細菌感染性疾病，破壞牙齒支持組織，導致牙齒的松動脫落。牙骨質是覆蓋在牙根表面的礦化組織，在牙周組織的發(fā)生、發(fā)育和再生中起著非常重要的作用，因此對成牙骨質細胞（cementoblast，CB）的來源、分化和分子生物學特征進行研究，探索成牙骨質細胞在牙周組織再生中的作用具有重要意義。

1 成牙骨質細胞的來源和分化

目前，傳統(tǒng)觀點認為成牙骨質細胞來源于間充質干細胞，牙根是在冠發(fā)育完成后由間葉細胞所形成。根部牙本質形成后，包繞牙根的Hertwig′s上皮根鞘（Hertwig′s epithelial root sheath，HERS）斷裂，牙囊細胞穿過破裂的HERS并接觸根部牙本質，分化為CB。還有學者認為早期成牙骨質細胞直接來源于上皮根鞘（epithelial root sheath，ERS）。

1.1 牙囊細胞：

傳統(tǒng)觀點認為成牙骨質細胞就是由牙囊細胞分化而來的。Villarreal等研究發(fā)現，經骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、釉基質衍生物（enamel matrix derivatives，EMD）和牙本質非膠原蛋白（dentin non-collagenous protein，dNCP）等誘導后，牙囊細胞可以形成成牙骨質細胞表型。Handa^[1]等從牛牙胚中分離出牛牙囊細胞（bovine dental follicle cells，BDFC）、牛齒槽成骨細胞（bovine alveolar boneosteoblasts， BAOB）和牛牙周膜細胞（bovine periodontal ligament cells， BPDL），并將其植入重度免疫缺陷的小鼠體內，4周后發(fā)現BDFC形成了牙骨質樣基質，BAOB形成骨樣基質，BPDL形成少量的牙骨質樣基質。上述實驗證實了CB由牙囊細胞分化而來，支持傳統(tǒng)觀點，但同時他們認為牙周膜中也存在成牙骨質先祖細胞。Handa等進一步研究發(fā)現，牙囊細胞受到BMP誘導可以表達牙骨質附著蛋白（Cementum attachment protein，CAP）和牙骨質蛋白（Cementum protein，CEMP）等成牙骨質細胞的標志蛋白。

1.2 上皮根鞘：

ERS是牙根發(fā)育中決定性的結構，是牙冠發(fā)育完成后成釉器內釉 外釉上皮在頸環(huán)處增生，向未來根尖孔方向生長，形成2層上皮的鞘。Zeichner等^[2]研究發(fā)現在牙齒發(fā)育過程中，ERS發(fā)生了由上皮細胞到間質細胞的轉變，分化為CB，并形成類似于無細胞牙骨質的礦化細胞外基質。因此他們認為無細胞牙骨質和細胞牙骨質由兩種不同類型的細胞合成，即ERS衍生的CB和神經嵴來源的CB。ERS僅在牙根發(fā)育階段分泌某些蛋白和信號分子參與牙骨質的形成。牙冠發(fā)育即將完成時，牙根開始發(fā)育。內釉和外釉上皮細胞在頸環(huán)開始增生，形成上皮根鞘。它與CB的起源關系密切。與根部牙本質相連的基底膜去掉，與牙囊組織聯合培養(yǎng)，結果雖有礦化物質生成，但沒有與根面相連。牙囊中的間充質細胞進入因變性而斷裂的上皮細胞之間，并與牙根表面接觸，在該處分化出CB。 目前關于成牙骨質細胞的來源尚無定論，還需進一步地研究證實。

2 成牙骨質細胞的分子生物學特征

2.1 成牙骨質細胞的形態(tài)結構：

牙根發(fā)育完成后，在正常的牙骨質中可見CB所在位置留下的陷窩。在鄰近牙骨質的牙周韌帶中，CB呈扁平裝、類圓形、多邊形或不規(guī)則形狀。CB細胞核圓或卵圓形，細胞表面有短鈍突起，周圍可見由它產生的原纖維及內在纖維。細胞平鋪于根面，當牙骨質形成時近似立方狀。電鏡觀察，細胞質內富含粗面內質網和滑面內質網，高爾基復合體發(fā)達，有較多的糖原顆粒，在胞漿內還可見到有界膜的膠原原纖維。Clayden等 ^[3]發(fā)現CB的形態(tài)受激素水平影響：當垂體被切除的大鼠磨牙牙骨質發(fā)生，CB核仁和核膜孔減少，高爾基復合體和內質網也顯著減少。

2.2 成牙骨質細胞的功能：

成牙骨質細胞的功能包括了表達礦化相關蛋白如骨鈣素（osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）等，分泌基質形成鈣化結節(jié)，形成牙骨質，表達CAP促進牙周膜細胞和牙齦成纖維細胞在牙根表面的黏附，成牙骨質細胞表達的OCN、BSP和CAP等在牙骨質形成和纖維黏附過程中起重要作用。成牙骨質細胞表達礦化相關蛋白，在鈣化條件下持續(xù)培養(yǎng)，可重疊生長并分泌骨基質形成鈣化灶。BSP在成牙骨質細胞形成細胞結節(jié)后開始不斷地進行增殖分化分泌礦化基質，形成礦化結節(jié)。在這一過程中，成牙骨質細胞一直表達BSP、ALP和CAP，并具有時序上的變化。在礦化過程中BSP參與了礦化中心的形成，并能誘導牙骨質樣結構的礦化。CAP是成牙骨質細胞特有的標記物，僅可由成牙骨質細胞產生。CAP雖然是一種具有活性的牙骨質非膠原蛋白，但其活性單一，僅促進成纖維細胞的黏附，而對成纖維細胞的有絲分裂無影響， CAP能明顯促進牙周韌帶細胞和牙齦成纖維細胞在牙根表面的黏附及移行。

OCN是一種相對分子質量非常小的含酸γ-碳氧血紅蛋白，而OPN和BSP則為磷酸化的糖蛋白，是牙骨質中非常重要的非膠原蛋白，它們都與CB形成牙骨質的功能密切相關。CAP是牙骨質中的一種特異性蛋白，能選擇性地促進成牙骨質細胞的前體細胞對牙根表面的移行黏附，并促進這些前體細胞向成牙骨質細胞系分化，增強其成骨活性。

2.3 成牙骨質細胞的體外培養(yǎng)：

培養(yǎng)不受成纖維細胞、成骨細胞、及成牙本質細胞等干擾的單一的CB系經歷了一個不斷完善、發(fā)展的過程。它是近年來轉基因動物、原位雜交、組織化學等新技術應用發(fā)展的結果。目前，世界上僅有少數實驗室成功地建立了牙骨質來源細胞的體外培養(yǎng)體系并以此作了系列研究。牙骨質瘤來源的 CB、CD1 小鼠來源的 CB 和牙周膜細胞、人牙骨質來源的 CB、人牙骨質薄層刮取物來源的 CB、大鼠第一磨牙來源的CB、人牙周膜來源的CB、牛牙骨質來源的CB、人CB細胞系克隆株來源的CB和馬后牙來源的CB在體外的分離培養(yǎng)^[4]。

Arzate等培養(yǎng)的來源于人牙骨質瘤的 CB，為多角形，其ALP活性為陽性。鑒別方法：CAP抗體染色陽性，特異性抗體免疫組化和蛋白質印跡染色顯示，這些細胞表達骨涎蛋白以及Ⅰ、Ⅴ型膠原，體外有礦化物形成。體外培養(yǎng)的人牙骨質瘤來源的 CB 可以合成和分泌牙骨質蛋白，如CAP、牙骨質衍生生長因子、血小板衍生生長因子和成纖維細胞生長因子。D’Errico等^[5]在利用原位雜交技術檢測CD1小鼠牙根發(fā)育期間礦化相關蛋白，如BSP、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）以及骨鈣蛋白（osteocalcin，OC）的時序表達時發(fā)現，41d齡CD1小鼠的CB高表達 BSP、OPN和OC，而牙周膜細胞不表達BSP、OPN 和OC。將41d齡CD1小鼠的150個下頜第一磨牙牙胚酶消化后行常規(guī)成骨細胞培養(yǎng)，原位雜交鑒別顯示，所培養(yǎng)的細胞表達Ⅰ型膠原、BSP、OPN和OC，但不表達牙本質涎蛋白，即所培養(yǎng)的細胞并非成牙本質細胞。Saygin等將拔下的阻生第三磨牙的軟組織清除，以其根中1/3表面刮取物行組織塊法培養(yǎng)，所培養(yǎng)的細胞用免疫細胞化學法染色。如果一種細胞同時符合以下3個標準則為OB：1，25-二羥膽鈣化醇誘發(fā)OC的釋放；1，25-二羥膽鈣化醇誘導ALP 高表達；礦化基質形成。用源于人類CB瘤的細胞代替正常CB進行相關研究，不失為一種方法，但這些細胞與CB之間的差別在多大程度上影響了這種替代，還有待進一步研究。

3 礦化相關蛋白對成牙骨質細胞增殖分化的影響

3.1 BMP和EMD對成牙骨質細胞的影響：

EMD是釉質發(fā)育過程中未礦化釉質中含有的蛋白成分，EMD可以由ERS內層細胞合成，并參與牙骨質的發(fā)生。BMP廣泛存在于骨組織、牙齒及牙周組織中，主要分布于具有成骨傾向的細胞中，并參與骨組織牙齒組織的形成。Kemoun等學者研究發(fā)現：BMP-2、7和EMD可以刺激牙囊細胞產生成牙骨質細胞的表型。牙囊細胞長時間受到BMP-2、7或EMD的刺激能提高ALP的活性并增加礦化，還能分泌出CAP和CEMP-23，證實BMP和EMD可以誘導牙囊細胞向成牙骨質細胞分化。

3.2 CEMP-1對成牙骨質細胞的影響：

CEMP-1能調節(jié)成牙骨質細胞活性，同時誘導不具有成骨特性的細胞向成牙骨質細胞方向分化。Carmona等學者研究表明：CEMP-1對羥磷灰石具有巨大的親和力，可以促進磷酸八鈣晶核體的形成，為牙骨質的生成提供礦化核心。人牙齦成纖維細胞轉染CEMP-1后能誘導礦化并能表達牙骨質基質蛋白，轉染后的牙齦成纖維細胞具有更高的ALP活性和增殖能力，并且表達BSP、OCN、OPN、CAP等礦化相關因子。

3.3 CAP對成牙骨質細胞的影響：

CAP可作為鑒別成牙骨質細胞及牙骨質的分子標志物。同時實驗證實^[6]：牙囊細胞、牙周韌帶細胞等具有分化為CB潛能的間充質細胞在分化過程中同樣表達CAP，因此CAP亦可作為鑒別牙周韌帶中具有分化為成牙骨質細胞潛能的間充質細胞的特異性標志；而細胞堿性磷酸酶（ALP）的表達可以作為牙骨質形成過程中CB分化早期的標志；礦化組織的形成則可作為CB分化末期的指標。Handa等將牛牙囊細胞與羥基磷灰石復合后植入免疫缺陷小鼠體內，4周后發(fā)現形成纖維組織和類牙骨質樣基質，CAP染色陽性；而植入的牙槽骨細胞生成的是骨樣結構，CAP染色陰性。Wen等發(fā)現在經含牙本質非膠原蛋白的牙囊細胞培養(yǎng)液處理后，脂肪干細胞由成纖維樣細胞轉變?yōu)槌裳拦琴|樣細胞，細胞表達CAP mRNA。在純鈦表面生長的牙周韌帶細胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）能高度表達CAP，提示體外培養(yǎng)的hPDLCs中存在牙骨質細胞表型，具有向成牙骨質細胞表型分化的潛能。在同樣條件下生長的hPDLCs，在牙骨質表面生長的hPDLCs顯著表達CAP，證明根面保留的牙骨質能促進hPDLC向成牙骨質細胞方向分化，從而有利于牙周組織再生。牙本質基質（treated dentin matrix，TDM）可以促進牙囊細胞分化為牙髓牙本質樣組織以及牙骨質-牙周復合體，CAP作為牙骨質形成的標志物之一用于鑒定所形成的牙骨質結構。體外實驗顯示CAP在高濃度時可增強人牙囊細胞的ALP活性，促使其黏附并向成牙骨質細胞分化，刺激其分泌礦化基質，從而形成早期的牙骨質和骨組織。

4 結語

牙骨質的再生在牙周組織再生過程中發(fā)揮著重要的作用，成牙骨質細胞是其中的關鍵所在。通過學者們的努力，我們對成牙骨質細胞的了解正逐步深入，這些成果不僅揭示了牙骨質及牙周組織再生的機制，也為治療牙周疾病打下了堅實的理論基礎。

參考文獻

[1] Handa K， Saito M， Yamauchi M. [J].Bone， 2002， 31（5）：606-611.

[2] Zeichner DM，Oishi K，Su Z.[J].Dev Dyn，2003，228（4）：651-663.

[3] Clayden AM，Young WG，Zhang CZ.[J].J Periodontal Res，1994，29（4）：266.

[4] 侯建霞，曹采方，孟煥新.牛牙骨質來源細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定[J].中華口腔醫(yī)學雜志，2002，37（2）：102

[5] D Errico JA， Berry JE， Ouyang H.[J].J Periodontol，2000，71（1）：63-72.

[6] Kemoun P，Laurencin S，Rue J. [J].Cell Tissue Res，2007，329（2）：283-294.