補骨脂提取溶媒研究及提取物含量測定

摘要：以補骨脂素和異補骨脂素的含量為指標，建立檢測方法來測定補骨脂提取物的含量。采用不同溶媒對補骨脂進行提取，通過提取物中補骨脂素和異補骨脂素的得率、經濟成本、安全性等角度來衡量最佳提取溶媒。結果表明，在相同溶劑倍量、提取時間和提取次數的條件下用80%乙醇為提取補骨脂中補骨脂素和異補骨脂素的最佳溶媒。

關鍵詞：補骨脂； 提取溶劑； 含量測定

【中圖分類號】

R917 【文獻標識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）07-0056-02

補骨脂別名和蘭莧、胡韭子等，為豆科植物補骨脂（Psoralea Corylifolia L.）的干燥成熟果實。主產于四川、河南、陜西、安徽等地。具有補腎壯陽、溫脾止瀉之功效，外用治療白癜風。現代藥理研究表明其具有舒張支氣管平滑肌、抗衰老、擴張冠狀動脈、增強皮膚色素等作用，是治療白癜風的特效藥。補骨脂素（Psoralen）和異補骨脂素（Iso psoralen）為呋喃香豆精類化合物，具有光敏、抗癌、解痙及止血等作用，是補骨脂的主要有效成分，補骨脂中還含有黃酮及查爾酮類化合物。中成藥中補骨脂和異補骨脂的測定方法已有較多報道，但對補骨脂提取溶媒的研究還未見有報道。本文以補骨脂素和異補骨脂素的含量為指標，考察了補骨脂的提取溶媒，從而為進一步開發補骨脂提供了一定的理論依據。同時為補骨脂提取物的生產提供依據。

1 材料與試劑

1.1 儀器：HP1100高效液相色譜儀系列（美國惠普），在線脫氣、四元泵、紫外檢測器，HP化學工作站；RE-52A旋轉蒸發儀；HH-2數顯恒溫水浴鍋；梅特勒精密電子天平。

1.2 試劑：甲醇（色譜純）、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、無水乙醇（所用試劑均為分析純）；補骨脂素對照品，批號739-9203；異補骨脂素對照品，批號738-8802（中國藥品生物制品檢定所提供）；補骨脂藥材購自安徽亳州四海藥材公司。

2 實驗方法

2.1 檢測方法的建立

2.1.1 色譜條件的建立： 檢測波長的選擇 將補骨脂素和異補骨脂素對照品分別用甲醇制成對照品溶液，進行紫外掃描，結果兩者均在245nm和295nm波長處有最大吸收，但245nm 波長處，兩者吸收均更靈敏，在此波長下，可減小進樣量，從而減少對色譜柱的污染，陰性對照無干擾，因此選定245nm為測定波長。

流動相的選擇 分別用體積比為80：20，70：30，60：40，50：50，40：60，30：70的甲醇-水系統作為流動相，對補骨脂素和異補骨脂素同時進行HPLC測定。結果表明：在以甲醇：水（50：50，V/V）為流動相，補骨脂素和異補骨脂素的分離度好，無雜質峰干擾，且相對保留時間適中。

色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS 柱（250×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-水（50：50，V/V）；流速1.0ml·min-1；檢測波長245nm；柱溫40℃；進樣量20μl；測定時間約為12min。

色譜圖：見圖1，圖2。

2.1.2 標準曲線的繪制：

分別精密稱取補骨脂素對照品5.8mg、異補骨脂素對照品4.7mg置100ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液。用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，配成5.8，11.6，17.4，23.2，29.0μg/ml系列濃度的補骨脂素溶液；4.7，9.8，14.1，18.8，23.5μg/ml系列濃度異補骨脂素溶液。經0.45μm微孔濾膜過濾，取續濾液20μl進樣，在上述色譜條件下進行HPLC分析，以峰面積為縱坐標（Y），以濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線。結果表明：補骨脂素在5.8～29. 0μg/ml濃度范圍內線性關系良好，回歸方程為Y =16235.35x- 2466.84，r=0.9999；異補骨脂素在4.7～23.5μg/ml濃度范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=15535.44x-6638.67，r=0.9997。

2.1.3 樣品溶液的制備：

補骨脂藥材25g粉碎成60目粗粉，加入8倍量的甲醇回流提取3次，每次提取2小時，合并濾過液，蒸干，殘渣用甲醇溶解，定容至25ml，再取1ml，用甲醇稀釋至10ml，密封，低溫避光保存，備用。

2.1.4 精密度實驗：

儀器精密度 分別吸取上述一定濃度的補骨脂素和異補骨脂素的對照品溶液，在上述色譜條件下，重復進樣6次，測得峰面積，計算相對標準偏差，結果見表1：

2.1.5 樣品溶液穩定性試驗：

取樣品溶液低溫避光放置0，1，2，4，6，8，10，12，24h后，在上述色譜條件下測定。結果表明，樣品溶液中補骨脂素和異補骨脂素在低溫避光條件下24h內穩定性良好，相對標準偏差RSD分別為2.31%和1.72%。

2.1.6 對照品溶液穩定性試驗：

取對照品溶液低溫避光放置0，1，2，4，6，8，10，12，24h后，在上述色譜條件下測定。結果表明，對照品溶液中補骨脂素和異補骨脂素在低溫避光條件下24h內穩定性良好，相對標準偏差RSD分別為2.19%和1.98%。

2.1.7 回收率試驗：

取樣品補骨脂25g，分別精密加入一定量的對照品溶液，8倍量的甲醇回流提取3次，每次提取2小時，在上述色譜條件下測定，平均回收率結果見表2。

2.2 提取溶媒及工藝

2.2.1 提取溶媒的選擇：

補骨脂素和異補骨脂素為香豆素成分，在有機溶劑中的溶解度會大些，但溶劑極性太小又會影響其提取物的得率，從而影響其收率。所以本實驗采用了石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、無水乙醇、65%的甲醇溶液、80%的甲醇溶液、95%的甲醇溶液、65%的乙醇溶液、80%的乙醇溶液、95%的乙醇溶液、水13種溶媒對補骨脂進行回流提取。

2.2.2 提取工藝：

將補骨脂粉碎成60目左右的粗粉，稱取100g粗粉13份，分別置于1500ml的圓底燒瓶中，編號1～13號，再分別量取石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、無水乙醇、65%的甲醇水溶液、80%的甲醇溶液、95%的甲醇溶液、65%的乙醇溶液、80%的乙醇溶液、95%的乙醇溶液、水800ml，水浴加熱回流提取2小時，150目濾布過濾，濾渣再加入各自溶劑800ml，再回流提取、過濾。共提取三次，合并濾液，回收濾液至稠膏狀，于真空烘箱內80℃減壓烘干，研磨成干粉，稱重，計算收率。取干粉1g，溶于500ml甲醇，超聲30分鐘，過濾，取溶液1ml用甲醇稀釋10倍，經0.45μm微孔濾膜過濾，作為樣品溶液，利用上述方法學進行含量測定，結果如下表3：

甲醇和乙醇提取能力相近，不同濃度的甲醇和乙醇的提取能力基本相當，其中80%的甲醇和80%的乙醇稍好些，雖然甲醇成本低于乙醇，但由于甲醇毒性較大，對環境不利，最好選擇80%的乙醇作為提取補骨脂的最佳溶劑。

2.2.3 將80%乙醇提取過的殘渣再用8倍量提取2小時，得到含量為0.82%的浸膏9.5g，占前三次所提取出來的香豆素的7.5%，可以認為沒有進行第四次提取的必要。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇：補骨脂素和異補骨脂素兩者均在245nm和295nm波長處有最大吸收，但245nm 波長處兩者吸收均更靈敏，在此波長下，可減小進樣量，從而減少對色譜柱的污染，陰性對照無干擾，因此選定245nm為測定波長。

3.2 雖然香豆素類成分具有遇堿開環，遇酸環合的性質，但由于補骨脂中含有大量油脂和糖類成分，易發生皂化反應和形成糊狀物，難以過濾，因此一般不采用堿液中加熱開環，酸液中閉環的原理來提取。

3.3 本實驗中補骨脂提取工藝中統一用8倍量溶媒提取3次，每次2小時，基本上可以將補骨脂素和異補骨脂素提取完全，提取率為90%左右。

3.4 雖然補骨脂素和異補骨脂素在有機溶劑中有較好的溶解度，但有機溶劑如石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等的穿透力相對較弱，香豆素類難以溶出，同時造成提取率偏低，水的穿透力較強，但對香豆素類的溶解度較小，提取率也偏低，純甲醇和純乙醇溶劑提取會造成成本增高，所以選用甲醇溶液和乙醇溶液，同時從綠色、安全的角度考慮，選用80%的乙醇溶液。

4 結論

4.1 通過對檢測波長的選擇、流動相選擇，確定檢測方法的條件為：流動相采用甲醇-水（50：50，V/V）；檢測波長為245nm；流速為1.0ml·min-1；柱溫為40℃；測定時間約為12分鐘。

4.2 通過精密度、穩定性、加樣回收實驗可以確定本檢測方法適用于補骨脂提取物的含量測定。

4.3 通過13種溶媒對補骨脂提取得率，香豆素得率的分析，同時考慮經濟、環保等因素，選定80%的乙醇為補骨脂中提取補骨脂素和異補骨脂素的最佳溶劑。

參考文獻

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