黃芩水煎液及聯合硫酸慶大霉素對銅綠假單胞菌生物膜的體外影響

摘要：目的： 研究黃芩水煎液體外對銅綠假單胞菌生物膜的影響及其與硫酸慶大霉素的協同殺菌效果。 方法： 采用對倍稀釋法和MTT法檢測黃芩水煎液對銅綠假單胞菌最低抑菌濃度（MIC）及其生物膜MIC（SMIC）的作用，及其與硫酸慶大霉素協同的效果。 結果： 黃芩水煎液對銅綠假單胞菌的MIC為1.95mg/ml， SMIC為31.25mg/ml，黃芩水煎液濃度在3.93mg/ml或以上時硫酸慶大霉素有明顯的抗菌協同作用。 結論： 黃芩水煎液體外對銅綠假單胞菌生物膜的形成有較為明顯的抑制作用，與硫酸慶大霉素聯合用藥有一定的抗菌協同作用。

關鍵詞：黃芩水煎液；銅綠假單胞菌；生物膜

【中圖分類號】

R917 【文獻標識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）07-0072-01

1 前言

銅綠假單胞菌是引起粘膜和創傷感染最常見的革蘭氏陰性菌，其極易形成生物膜，產生耐藥性。在國內研究表明，清熱解毒藥物中的某些藥物對治療慢性感染有較好的效果。為了更多的發掘出抗銅綠假單胞菌生物膜的藥物，本課題從清熱解毒藥物中選取黃芩，研究其對銅綠假單胞菌生物膜的影響，以及與抗生素合用的協同作用，為黃芩抗銅綠假單胞菌生物膜和聯合硫酸慶大霉素用藥提供實驗依據。

2 材料與儀器

2.1 材料：銅綠假單胞菌1株，由安徽中醫學院微生物與免疫教研室于臨床分離獲得，并經鑒定。黃芩100 g，購于國泰大藥房。水煎2次，合并濃縮成50%濃度藥液（含生藥500mg/ml）。硫酸慶大霉素注射液，80mg/2ml（湖北同濟奔達鄂北制藥有限公司）。胰酶大豆肉湯（杭州微生物試劑有限公司）。四甲基偶氮唑鹽（MTT，Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO，天津市光復精細化工研究所，分析純）。

2.2 檢測儀器：318酶標儀（上海三科儀器有限公司），96孔微量培養板（杭州生友生物技術有限公司），DPH-9162型電熱恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）。倒置顯微鏡（OLYMPUS C×41）

3 方法

3.1 細菌計數：菌落計數法測定細菌濃度：2.98×1014CFU/ml；調整濃度至2.98×105 CFU/ml、2.98×109 CFU/ml，備用。

3.2 黃芩水煎液對銅綠假單胞菌MIC的測定：依據NCCLS 的M27- A 方案^[3]，將黃芩水煎液以胰酶大豆肉湯稀釋成10個濃度梯度：500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.87、3.93、1.95、0.98 mg/ml，分別加入96孔板，100μl/孔，每個濃度8個復孔。加入調整至2.98×109CFU/ml菌體的混懸液100μl，37℃培養48h，接種于無菌固體培養皿中，37℃培養24h，以無菌生長的最小藥物稀釋度作為銅綠假單胞菌的MIC。

3.3 黃芩水煎液對銅綠假單胞菌SMIC：將100μl調整至2.98×105CFU/ml的細菌懸浮液分別加入96孔板，37℃培養48h，使銅綠假單胞菌完全粘附于平底的96孔板表面，形成銅綠假單胞菌生物膜的結構。生物膜形成后，棄去培養基及懸浮菌，用PBS洗3次，將黃芩水煎液以胰酶大豆肉湯稀釋成10個濃度梯度：500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.87、3.93、1.95、0.98 mg/ml，分別加入96孔板，100μl/孔，每個濃度8個復孔。繼續培養48h，倒置顯微鏡下觀察其形成情況。MTT法檢測抑制生物膜的藥物濃度：即50μl的MTT溶液（ 貯存液含5mg/ml PBS， 臨用前用預溫的0.15M PBS 按1∶5 稀釋） 加入每孔中， 37℃孵育5h。棄去含MTT 的培養基， PBS 洗3 遍， 加入DMSO 100μl， 振蕩5min， 在酶標儀492nm 波長下檢測吸光度。設未加藥孔為空白對照。

3.4 硫酸慶大霉素對銅綠假單胞菌MIC的測定：將硫酸慶大霉素注射液以胰酶大豆肉湯稀釋成10個濃度梯度：125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0.25μg/ml，分別加入96孔板，100μl/孔， 每個濃度8個復孔。加入調整至2.98×105CFU/ml菌體的混懸液，100μl/孔。37℃培養48h， 接種于無菌固體培養皿中，37℃培養24h，以無菌生長的最小藥物稀釋度作為銅綠假單胞菌的MIC。

3.5 黃芩水煎液聯合硫酸慶大霉素對銅綠假單胞菌的MIC：將黃芩水煎液以胰酶大豆肉湯稀釋成10個濃度梯度：500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.87、3.93、1.95、0.98 mg/ml，分別加入96孔板，50μl/孔， 每個濃度8個復孔。加入濃度調整為0.98μg/ml的硫酸慶大霉素注射液，50μl/孔。加入調整至2.98×109CFU/ml菌體的混懸液100μl，37℃培養48h， 接種于無菌固體培養皿中，37℃培養24h，以無菌生長的最小藥物稀釋度作為銅綠假單胞菌的MIC。觀察其是否有抗菌協同作用。

4 結果

4.1 黃芩水煎液、硫酸慶大霉素、黃芩水煎液聯合硫酸慶大霉素對銅綠假單胞菌MIC：

由表1可知，黃芩水煎液與硫酸慶大霉素聯合用藥有一定的抗銅綠假單胞菌協同作用。

4.2 黃芩水煎液對銅綠假單胞菌SMIC： 經MTT法檢測，黃芩水煎液對銅綠假單胞菌SMIC為31.25mg/ml。倒置顯微鏡下觀察結果見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下觀察銅綠假單胞菌的生物膜情況（×4000）

a.對照孔，b.銅綠假單胞菌培養24h（未形成生物膜），c. 銅綠假單胞菌培養48h（形成生物膜），d.藥物濃度31.25 mg/ml作用后銅綠假單胞菌的生物膜，e. 藥物濃度125mg/ml作用后銅綠假單胞菌的生物膜

由上可知，黃芩水煎液藥物濃度在3.93mg/ml以下時對銅綠假單胞菌無顯著性抑制作用；藥物濃度達到3.93mg/ml或以上時抑制效果較為明顯。

5 討論

為了從中藥中發掘具有抗銅綠假單胞菌BF的藥物，本實驗通過研究清熱解毒藥中的黃芩在體外對銅綠假單胞菌BF的影響，來尋找抗銅綠假單胞菌BF的更為有效的新藥。結果顯示，黃芩水煎液對銅綠假單胞菌懸浮菌的最低抑菌濃度（MIC）為1.95mg/ml，對生物膜的SMIC為31.25mg/ml，黃芩水煎液濃度在0.98mg/ml或以上時對硫酸慶大霉素有協同作用。

黃芩水煎液聯合硫酸慶大霉素對銅綠假單胞菌作用的結果表明，黃芩水煎液與硫酸慶大霉素聯合用藥有一定的協同作用，其產生協同作用的機理有待于進一步研究。

本實驗結果表明，生物膜是黃芩抗銅綠假單胞菌的作用靶點之一，其是否有其它靶點值得進一步研究。

參考文獻

[1] 彭程，肖永紅.大環內酯類藥物對銅綠假單胞菌生物膜的作用[J]. 中國抗感染化療雜志，2001，1（1）：7-9.

[2] 杜虎 ，陳在賢.氟喹諾酮類藥物對銅綠假單胞菌生物膜的清除效應[J]. 重慶醫學，2005，34（4）：592-594.

[3] National Committee for Clinical Laboratory Standards， 1997. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts： approved standard. NCCLS document M27- A. National Committee for Clinical Laboratory Standards， Wayne， Pa.