豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）遺傳變異與疫苗免疫、發(fā)病機(jī)理及診斷的關(guān)系

摘 要：豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病（PCVAD）的發(fā)生依賴豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）的感染，表現(xiàn)為一群復(fù)雜的多因子綜合征。目前在野外流行的PCV2被分為PCV2a和PCV2b兩個(gè)亞群。北美和其它國(guó)家PCVAD的暴發(fā)通常與主要基因型從PCV2a轉(zhuǎn)變?yōu)镻CV2b有關(guān)。因此，有人提出基因型存在致病性和抗原性差異。總體來(lái)說(shuō)，毒力是特定PCV2分離株的特性，與基因型無(wú)關(guān)。此外，報(bào)道證實(shí)只有少數(shù)抗原差異。就免疫病理學(xué)而言，位于衣殼蛋白C端一個(gè)保守的誘騙表位為不能鑒定基因型之間的致病力差異提供了解釋。最后本文討論了PCV2的遺傳變異對(duì)疫苗和診斷方法的影響。

關(guān)鍵詞：PCV2；PCV2致病機(jī)理；PCV2遺傳變異；

中圖分類(lèi)號(hào)：S852 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：C 文章編號(hào)：1001-0769（2014）08-0058-02

20世紀(jì)90年代早期最先報(bào)道了豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病（PCVAD），此后該病發(fā)展為全世界經(jīng)濟(jì)上重要的疾病（Allan和Ellis，2000）。PCVAD的發(fā)生和發(fā)展與豬圓環(huán)病毒2型感染有關(guān)。PCVAD包括一群不同的多因子綜合征，如豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）、豬呼吸道混合疾病（PRDC）、繁殖障礙和其它（Chae，2004，2005；Opriessnig等，2007；Ramamoorthy和Meng，2009）。雖然限菌豬在不感染PCV2可以復(fù)制出PDNS（Krakowka等，2008），但是臨床表現(xiàn)PDNS的豬體內(nèi)有高水平PCV2特異性抗體，說(shuō)明PCV2與疾病發(fā)展有關(guān)（Thomson等，2002；Wellenberg等，2004）。PCV2感染的一個(gè)更加微妙的表現(xiàn)是它在健康豬群中生長(zhǎng)較差（Horlen，2008）。最近報(bào)道了一種稱(chēng)為急性肺水腫（APE）的新型超急性綜合征，它發(fā)生在免疫的豬群（Cino-Ozuna等，2011）。與之前描述的慢性漸進(jìn)性的綜合征不同，APE在健康動(dòng)物呈現(xiàn)急性肺部痛苦，然后幾乎迅速死亡。

豬圓環(huán)病毒屬環(huán)狀病毒科。該病毒科包括一群感染豬和禽的短的單鏈DNA病毒。在環(huán)狀病毒屬中，PCV2和PCV1關(guān)系密切。豬圓環(huán)病毒1.7 Kb的雙義基因組中編碼了至少兩個(gè)病毒復(fù)制必須的開(kāi)放閱讀框（ORFs）。最大的ORF1編碼復(fù)制酶蛋白R(shí)ep和Rep’（Mankertz和Hillenbrand，2001）。ORF1位于正義鏈方向，靠近PCV2基因組復(fù)制的起始位點(diǎn)。Rep由整個(gè)ORF1轉(zhuǎn)錄子翻譯而來(lái)，而Rep’由ORF1轉(zhuǎn)錄子選擇性剪切產(chǎn)生。Rep’ C端的68個(gè)氨基酸（aa）來(lái)自不同的開(kāi)放閱讀框。ORF2位于反義鏈方向，編碼233或234aa的病毒衣殼蛋白（CP）。CP參與了同聚衣殼的形成，并且有可能在病毒復(fù)制過(guò)程中將病毒基因組轉(zhuǎn)移至核內(nèi)（Liu等，2001；Nawagitgul等，2000）。最近Khayat等（2011）報(bào)道了單體CP亞基的晶體結(jié)構(gòu)和其在PCV2病毒樣顆粒中的方向。該模型中，60 個(gè)CP亞基形成了T=1的二十面體對(duì)稱(chēng)。圖1表示了PCV2 CP單體的計(jì)算機(jī)模型和它衣殼中的位置。

1 PCV2分離株的進(jìn)化和分類(lèi)

1.1 圓環(huán)病毒的起源

植物病毒家族中矮縮病毒科和復(fù)染色體病毒科與環(huán)狀病毒親緣關(guān)系最近。這些家族成員都有一個(gè)共通的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，包括了環(huán)狀病毒基因組的復(fù)制起始位點(diǎn)（Ori）。Gibb和Weiller（1999）對(duì)環(huán)狀病毒和矮縮病毒的Rep肽段序列分析后提出環(huán)狀病毒進(jìn)化起源的機(jī)制。該研究發(fā)現(xiàn)矮縮病毒和環(huán)狀病毒Rep N端區(qū)域具有相似性。不過(guò)PCV Rep的C末端與脊椎動(dòng)物RNA病毒—杯狀病毒的RNA結(jié)合蛋白2C更加近似。推測(cè)重組的位點(diǎn)位于PCV1 Rep的129至178位之間。杯狀病毒2C序列的存在表明PCV由矮縮病毒和脊椎動(dòng)物杯狀病毒重組而來(lái)。因?yàn)榘s病毒復(fù)制不依賴RNA，杯狀病毒擁有RNA基因組，2C序列可能通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒或還原轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄酶完成合并。該事件的確切時(shí)間未知。一種假設(shè)是環(huán)狀病毒在它們的禽類(lèi)和哺乳動(dòng)物宿主體內(nèi)共同演化，說(shuō)明圓環(huán)病毒大約在300萬(wàn)年前鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物多樣化之前就存在。然而，F(xiàn)irth等（2009）的研究推測(cè)圓環(huán)病毒僅僅出現(xiàn)在最近的500年。

就PCV2持續(xù)進(jìn)化而言，F(xiàn)irth等（2009）對(duì)160個(gè)全長(zhǎng)PCV2基因組分析顯示突變率為1.2×10-3替代/位點(diǎn)/年（s/s/y）。最近Perez等（2001）對(duì)來(lái)自古巴的PCV2基因組（3.1×10-3 s/s/y～ 6.6×10-3 s/s/y）分析也得到相同的結(jié)果。總的來(lái)說(shuō)這些數(shù)據(jù)表明，PCV2擁有比其他DNA病毒更高的突變率，但是多數(shù)RNA病毒遺傳變異率低（Duffy等，2008）。

對(duì)環(huán)狀病毒家族的6個(gè)成員[鳥(niǎo)嘴和羽毛病毒、鴿皰疹病毒、鵝環(huán)狀病毒、俄國(guó)鴨圓環(huán)病毒、PCV1和PCV2（Hughs和Piontkivska，2008）]的多樣性評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同義核酸比非同義核酸多，說(shuō)明PCV2正在進(jìn)行純化篩選。有趣的是，PCV2在Rep有大量的非同義核苷酸改變，而其他5種病毒中沒(méi)有該現(xiàn)象。作者得出結(jié)論，非常低的突變率可能是由于種群瓶頸，然后是種群擴(kuò)張。

1.2 PCV2的出現(xiàn)

20世紀(jì)70年代早期，Tischer等（1974）報(bào)道某種病毒污染了豬腎細(xì)胞系PK-15（ATCC-CCL3）。生化分析表明該病毒為環(huán)狀單鏈DNA基因組，因此命名為豬圓環(huán)病毒（PCV；Tischer等，1982）。早期實(shí)驗(yàn)性感染表明，PK-15污染病毒后引發(fā)無(wú)臨床癥狀的疾病（Tischer等，1986）。20世紀(jì)90年代早期，加拿大出現(xiàn)了一種稱(chēng)為PMWS的新型豬衰竭性疾病（Clark，1997；Harding，1997）。利用PCV特異性單克隆抗體進(jìn)行電鏡和免疫組化實(shí)驗(yàn)，證實(shí)感染豬的組織中有圓環(huán)病毒。使用PCV1特異性引物進(jìn)行PCR，分析擴(kuò)增的DNA序列，發(fā)現(xiàn)該病毒與Thscher（Meehan等，1998）報(bào)道的大約有70 %相似性。人們使用PCV1和PCV2命名來(lái)區(qū)別非致病性的PK15污染病毒和新分離得到的PMWS相關(guān)株。

Jacobsen等（2009）對(duì)來(lái)自德國(guó)北部的存檔組織進(jìn)行回顧研究，發(fā)現(xiàn)在1962年的組織中有PCV2特異性DNA序列。分析的樣本包括表現(xiàn)PMWS疑似癥狀臨床癥狀的豬。使用原位雜交和PCR技術(shù)得到在1962年至1984年組織中PCV2的檢出率大約為2.5 %。1985年開(kāi)始，PCV2的檢出率突然上升至30 %。這一上升與PCV2相關(guān)組織病變的出現(xiàn)相關(guān)。對(duì)1985年樣品的ORF2序列分析，得知其與PCV2a基因群有相似性。人們?cè)噲D從早期樣本中擴(kuò)增PCV2的DNA，但是只能從ORF1擴(kuò)增小PCR片段，不足以將其與當(dāng)代病毒準(zhǔn)確比較。英國(guó)對(duì)1980年的存檔組織進(jìn)行研究也得到了相似的結(jié)果，說(shuō)明復(fù)原的ORF2序列與PCV2a有關(guān)（Grierson等，2004）。

雖然PCV2a樣序列在1980年就有報(bào)道，一些研究推測(cè)病毒的PCV2b基因型最近才出現(xiàn)。比如2005年以前，PCV2a病毒在北美豬群地方流行。然而，2005年加拿大和隨后美國(guó)都報(bào)道了嚴(yán)重的PCVAD。提交的診斷案例和野外調(diào)查表明暴發(fā)的PCVAD與PCV2b基因型的出現(xiàn)具有很強(qiáng)的相關(guān)性（Carman等，2008；Cheung等，2007；Horlen等，2007）。在其他國(guó)家包括中國(guó)（Wang等，2009）、泰國(guó)（Jangtafong，2011）、韓國(guó)（Guo等，2010）、丹麥（Dupont等，2008）和瑞士（Wiederkehr等，2009）也報(bào)道了PCV2b的出現(xiàn)和PCV2a呈地方性流行。一個(gè)丹麥的2C基因型（Dupont，2008）復(fù)蘇自1980年的組織檔案，可能代表了當(dāng)代基因型的祖先。基于這些和其它研究，Patterson和Opriessnig（2010）提出了PCV2在北部德國(guó)和最終散播到歐洲、亞洲、美洲和澳洲的時(shí)間表。

1.3 PCV2的分類(lèi)和系統(tǒng)發(fā)生的關(guān)系

PCV2分離株早期序列分析顯示可以將其分類(lèi)到明確的亞型和基因型。因?yàn)閲?guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)（ICTV）不描述種層面下的病毒，許多人提出將PCV2歸入特定的基因亞群，即PCV2a和2b。表1總結(jié)了PCV2a和PCV2b的歷史命名。Segale等（2008）提議統(tǒng)一命名系統(tǒng)，將PCV2內(nèi)各基因型以小寫(xiě)字母表示，如PCV2a、2b和2c。表2列舉了目前基因型中代表性分離株的Genebank登錄號(hào)按照配對(duì)序列比較的方法（PASC）決定變異度（p），從而將分離株歸入基因群。變異度p是通過(guò)計(jì)算基因組中堿基差異求得的。目前PCV2基因型分類(lèi)有兩種方法。基于對(duì)PCV2全基因組的分析，切斷值p=0.02被用于區(qū)分基因型（Grau-Roma等，2008）。基于對(duì)ORF2的變異程度（Fenaux等，2000；Hamel等，2000；Larochelle等，2002；Manertz等，2000），切斷值上升至p=0.035（Segale等，2008）。目前的標(biāo)準(zhǔn)基于ORF2來(lái)鑒別亞型。使用完整的PCV2基因組或ORF2核酸序列做進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)兩種方案沒(méi)有區(qū)別（Olvera等，2007）。三個(gè)基因型的全基因組的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)見(jiàn)表2。該樹(shù)表明了不同PCV2基因型的分類(lèi)。

最近Wang等（2009）對(duì)中國(guó)分離株的序列分析后，提出了兩個(gè)新的基因型，命名為PCV2d和PCV2e。隨后Cortey等（2011）對(duì)序列數(shù)據(jù)的分析不能支持新的分類(lèi)。

Olvera等（2007）提出了進(jìn)一步對(duì)組內(nèi)分離株進(jìn)行分類(lèi)的方法。按照該方法PCV2a分為5個(gè)進(jìn)化枝，命名為PCV 群II A-E，PCV2b分為3個(gè)進(jìn)化枝，命名為PCV群I A，B和C。在該系統(tǒng)分類(lèi)下，2群（2a）進(jìn)化枝的距離為0.015 8，群I（2b）進(jìn)化枝距離為0.023 4。進(jìn)化枝分類(lèi)的關(guān)系未知。

遺傳重組使病毒的分類(lèi)變得復(fù)雜（Cai等，2011；Hesse等，2008；Lefebvre等，2009；Ma等，2007）。重組的前提需要超過(guò)一個(gè)病毒同時(shí)感染細(xì)胞。Horlen等（2007）和Hesse等（2008）在患有PCVAD豬的樣本中發(fā)現(xiàn)同時(shí)感染PCV2a和PCV2b。香港最早報(bào)道了同時(shí)帶有PCV2a和PCV2b的病毒（Ma等，2007）。這一結(jié)果表明中國(guó)病毒之間重組是頻繁的事件。基于系統(tǒng)進(jìn)化上的不協(xié)調(diào)，Hesse等（2008）報(bào)道了一個(gè)擁有來(lái)自PCV2a的ORF1和來(lái)自PCV2b的ORF2的病毒。此后許多報(bào)道證實(shí)PCV2a/2b嵌合病毒是非常常見(jiàn)的（Cheung，2009；Kim等，2009；Lefebvre等，2009）。雖然早先的研究提出重組由熱點(diǎn)或分解點(diǎn)產(chǎn)生（Ma等，2007），實(shí)驗(yàn)性的模型證實(shí)基因組任何位點(diǎn)都可以作為病毒間遺傳交換的位點(diǎn)（Cai等，2011）。同時(shí)擁有來(lái)自PCV1的ORF1和來(lái)自PCV2a的ORF2的嵌合病毒的而發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步證實(shí)PCV基因組的可塑性（Gagnon等，2010）。□□

（未完，待續(xù)）