淺談動物細(xì)胞培養(yǎng)工藝中的監(jiān)測與控制技術(shù)

在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，隨著細(xì)胞的增殖、底物的消耗及產(chǎn)物的生成，整個培養(yǎng)系統(tǒng)的狀態(tài)一直在產(chǎn)生變化。而各種狀態(tài)變量都有其限制范圍，當(dāng)超出其界限值時就會對培養(yǎng)過程產(chǎn)生消極的影響，降低培養(yǎng)效率。因此在動物細(xì)胞的培養(yǎng)工藝中，利用過程監(jiān)測與控制技術(shù)使培養(yǎng)系統(tǒng)保持在最佳的狀態(tài)也是整個工藝中重要的一環(huán)。

過程監(jiān)測是指應(yīng)用各種檢測技術(shù)對培養(yǎng)過程中狀態(tài)變量的變化進(jìn)行追蹤的行為。當(dāng)這些變量與預(yù)測值或與預(yù)期變化方式相偏離時，通過過程監(jiān)測的手段便可以及早發(fā)現(xiàn)并開始利用已設(shè)定的模型計算如何改變培養(yǎng)狀態(tài)以及時補(bǔ)償這種偏離。而過程控制則利用過程監(jiān)測所提供的信息按照暨定方案進(jìn)行調(diào)整，以使培養(yǎng)過程向更好的方向發(fā)展。

一、在線測量

大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)中由于大量細(xì)胞的代謝，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境迅速改變，在線過程監(jiān)控更為重要。離線取樣測定特別是產(chǎn)物濃度測定往往需要一天的時間，因此這種測定結(jié)果，不能用來及時指導(dǎo)生物反應(yīng)器有關(guān)參數(shù)的控制和細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化，而且頻繁取樣容易造成污染，增加費(fèi)用。因此在線測定生物反應(yīng)器中培養(yǎng)條件、代謝產(chǎn)物和目的產(chǎn)物濃度等大量數(shù)據(jù)，并對測定結(jié)果進(jìn)行分析處理，及時對培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行反饋控制是成功進(jìn)行大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)的需要。

在培養(yǎng)過程中對于過程監(jiān)測與控制具有重要意義同時又可在線測量的參數(shù)主要包括：溫度、PH值、pO2、攪拌速率、補(bǔ)料速率、罐壓以及排出氣體中O2和CO2的分壓，等等。因此，在工業(yè)上應(yīng)用生物反應(yīng)器進(jìn)行動物細(xì)胞培養(yǎng)時，這些參數(shù)都是被在線測量的對象。溫度與PH值這兩個參數(shù)對于細(xì)胞而言是最基本的影響因素，而在控制時往往與其它參數(shù)相獨(dú)立。溫度的測量通常在生物反應(yīng)器內(nèi)部單一位置，采用熱敏電阻檢測器（如Pt100熱電阻）進(jìn)行。PH值則多用復(fù)合式玻璃電極測量。Clark復(fù)膜氧電極則是溶解氧濃度最常用的檢測元件。所有此類檢測元件都已成為生物反應(yīng)器的標(biāo)準(zhǔn)配置。

攪拌轉(zhuǎn)速的檢測一般是通過應(yīng)用磁感應(yīng)式，光感應(yīng)式或測速發(fā)電機(jī)來實(shí)現(xiàn)的。磁感應(yīng)式和光感應(yīng)式檢測器是通過計測脈沖數(shù)來測量轉(zhuǎn)速的。安裝在攪拌軸或電機(jī)軸上的切片切割磁場或光束而產(chǎn)生脈沖電訊號，則脈沖頻率就反映了攪拌轉(zhuǎn)速的大小。而測速發(fā)電機(jī)是安裝在攪拌軸或電機(jī)軸上的小型發(fā)電機(jī)，它的輸出電壓和轉(zhuǎn)速間有良好的線性關(guān)系。

補(bǔ)料速率直接影響到培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，它的值多由輸送液體所用泵的單位流量與輸送時間來計算，而泵的單位流量需在培養(yǎng)開始前用補(bǔ)料管道進(jìn)行實(shí)際校準(zhǔn)。如果不斷對補(bǔ)料瓶內(nèi)的剩余體積進(jìn)行監(jiān)測，則可以得到足夠精確的補(bǔ)料數(shù)據(jù)來計算其他參數(shù)。

對于通氣流量測定有多種不同的方法。根據(jù)作用原理，流量計可分成兩大類型：體積流量型和質(zhì)量流量型。體積流量型是根據(jù)流體動能的轉(zhuǎn)換以及流體流動類型的改變而設(shè)計的測量裝置。它會引起流體能量的不同程度的損失，而且測量值受到溫度和壓力變化的影響。其主要形式有同心孔板壓差式流量計和轉(zhuǎn)子流量計。質(zhì)量流量型是根據(jù)流體的固有性質(zhì)，如質(zhì)量、導(dǎo)電性、電磁感應(yīng)性、離子化、熱傳導(dǎo)性能等進(jìn)行設(shè)計的流量計。如利用熱傳導(dǎo)性能對空氣進(jìn)行測量時沒有能量損失，也不受溫度和壓力的影響。在對尾氣中O2與CO2濃度的測量上可以利用質(zhì)譜儀進(jìn)行，但實(shí)際生產(chǎn)與實(shí)驗中常利用O2的順磁性和CO2的紅外吸收特性進(jìn)行測定。

二、狀態(tài)估計

過程變量估計問題大致可以分為兩類：狀態(tài)估計和參數(shù)估計，所謂狀態(tài)變量即是指表示系統(tǒng)動態(tài)過程的性態(tài)所需的一組最少數(shù)目的變量，它是描述過程內(nèi)在本質(zhì)的，不一定是物理上可測的變量；而參數(shù)一般即指數(shù)學(xué)模型方程中待定的未知系數(shù)。狀態(tài)和參數(shù)的基本區(qū)別在于前者隨時間變化，而后者隨時間保持不變或緩慢變化。

對細(xì)胞培養(yǎng)過程所處的狀態(tài)進(jìn)行分析時，最直接的方法就是通過在線測量獲得數(shù)據(jù)，再將其代入已有的過程模型中，從而得到關(guān)鍵狀態(tài)變量（如細(xì)胞密度、代謝速率、產(chǎn)物濃度等）的估計值。細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，對環(huán)境的微小變化也是極為敏感的，因此狀態(tài)估計所用的模型參數(shù)也處于不斷變化之中。故而狀態(tài)估計的問題就在于如何從一個運(yùn)行中的培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)不斷獲得必需狀態(tài)參數(shù)的修正值，從而利用在線測得的直接數(shù)據(jù)正確地分析培養(yǎng)過程所處的狀態(tài)。用于狀態(tài)估計的技術(shù)按照其性質(zhì)及在實(shí)踐中的應(yīng)用可分為許多類型。

三、過程控制的基本類型

控制系統(tǒng)在對培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行調(diào)整時可以采用許多模式?？傮w上可分為開環(huán)（open-loop）控制系統(tǒng)與閉環(huán)（close-loop）控制系統(tǒng)。

（一）開環(huán)控制系統(tǒng)

若系統(tǒng)的控制器與被控對象之間只有順向作用，沒有反向作用，即系統(tǒng)的輸出量對控制作用沒有影響，則稱該系統(tǒng)為開環(huán)控制系統(tǒng)。以細(xì)胞培養(yǎng)過程為例，這種控制模式的中心思想是在維持常規(guī)參數(shù)（溫度、攪拌、DO、pH等）穩(wěn)定的同時，通過已建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測某一時間點(diǎn)細(xì)胞的生長代謝狀態(tài)，估算氨基酸代謝通路和流量以及ATP的消耗，并以此作為培養(yǎng)基補(bǔ)加策略及成分調(diào)整的依據(jù)，在細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生改變之前做出調(diào)整。在這方面，關(guān)于雜交瘤生長和單抗生成的多種數(shù)學(xué)模型已經(jīng)建立。系統(tǒng)化、結(jié)構(gòu)化的補(bǔ)料策略也有了相當(dāng)?shù)陌l(fā)展，但由于這種模式要求對細(xì)胞生長和代謝的每一個細(xì)節(jié)都很清楚，在目前對生物體復(fù)雜的內(nèi)在機(jī)理認(rèn)識不足的情況下，理論預(yù)測與培養(yǎng)實(shí)踐仍有很大差距，這使得理論模型應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)受到了很大限制。

（二）閉環(huán)控制系統(tǒng)

系統(tǒng)的輸出量或狀態(tài)變量對控制作用有直接影響的系統(tǒng)稱為閉環(huán)控制系統(tǒng)。閉環(huán)模式相對于開環(huán)模式主要的區(qū)別是不需要建立模型去預(yù)測細(xì)胞和微環(huán)境將來的變化，而是通過在線（on-line）和/或離線（off-line）檢測手段獲得狀態(tài)數(shù)據(jù)，由人工或控制軟件根據(jù)當(dāng)前值的變化即時調(diào)整培養(yǎng)設(shè)定參數(shù)，使培養(yǎng)系統(tǒng)始終處于最佳狀態(tài)。這種模式是在細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生改變之后做出調(diào)整，也稱為反饋控制模式。細(xì)胞培養(yǎng)過程中溫度、PH及溶解氧濃度等基本變量的控制都是采用閉環(huán)模式進(jìn)行的。同時由于控制的目的是減小實(shí)測值與設(shè)定值間的差距，因此屬于負(fù)反饋控制。

（三）PID（proportional integral derivative）控制模型

在培養(yǎng)實(shí)踐中，一些狀態(tài)變量如溫度，只需要控制在37℃或其他固定的點(diǎn)上就可以滿足要求，則其控制采用“三點(diǎn)控制模式”即可。具體控制過程是首先以設(shè)定點(diǎn)為基準(zhǔn)設(shè)置上、下限，當(dāng)溫度高于/低于設(shè)定上限時啟動/關(guān)閉冷卻系統(tǒng)，當(dāng)溫度低于/高于設(shè)定下限時啟動/關(guān)閉加熱系統(tǒng)，如此使溫度保持恒定。但在對更多的狀態(tài)變量（如PH，補(bǔ)料速率）進(jìn)行閉環(huán)控制時采用這種簡單的方法會導(dǎo)致狀態(tài)變量不斷地圍繞設(shè)定值波動，對細(xì)胞的生長與代謝產(chǎn)生不良影響。

參考文獻(xiàn)：

[1]林福玉，陳紹烈，劉紅等.大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)的問題及對策.生物技術(shù)通報，2009，7（1）：32-35

[2]胡顯文，李佐虎，陳建新等.氣液雙升式反應(yīng)器動物細(xì)胞培養(yǎng)及批式生長動力學(xué)模型.生物技術(shù)通訊，2008，10（2）：104-108.