復凝聚法制備球孢白僵菌微膠囊

摘要[目的]研究復凝聚法制備以明膠和阿拉伯膠為壁材的球孢白僵菌（Beauveria bassiana）微膠囊的工藝。[方法]通過單因素試驗研究了明膠濃度、阿拉伯膠濃度、芯壁比、pH、反應溫度和轉速對微膠囊包埋效率的影響，再通過正交優化試驗確定最佳制備條件；利用光學顯微鏡、掃描電子顯微鏡和粒徑測微儀對球孢白僵菌微膠囊形態及粒徑分布進行表征。[結果]復凝聚法制備球孢白僵菌微膠囊最佳工藝條件為明膠濃度1.5%、阿拉伯膠濃度0.5%、芯壁比1.0∶1.5、復凝聚反應pH 3.8、攪拌速度450 r/min，在該條件下可制得包埋率達78.32%、粒徑分布均勻且平均粒徑在44.16 μm左右、流動性好的球型固體微膠囊。 [結論]該研究制備的微膠囊符合實際應用需求，為真菌殺蟲劑的研制提供了理論依據。

關鍵詞 球孢白僵菌；明膠；阿拉伯膠；復凝聚法；微膠囊

中圖分類號S482.3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）29-10179-04

基金項目“十二五”農村領域國家科技計劃項目（2011BAD37B014）；黑龍江省科技計劃項目（GA09B2033）。

作者簡介李姍（1989-），女，吉林長春人，碩士研究生，研究方向：有害昆蟲綜合治理。* 通訊作者，教授，博士生導師，從事森林病蟲害生物防治研究。

球孢白僵菌是目前世界上研究和應用最多的昆蟲病原真菌之一， 能侵染15個目149個科的700多種昆蟲[1]，具有對人、畜及生態環境影響小、容易培養、致病性強、防治害蟲效果好、保護害蟲天敵、害蟲不易產生抗性、適應性強等特點，已被用于防治多種農林害蟲[2]。但在實踐應用中，無論是直接使用原菌粉、孢子粉或者使用白僵菌劑型， 對外界環境，如溫度、濕度、干旱、光照等，都較敏感。其中一個重要影響因素便是太陽光中的紫外線對孢子的殺傷會降低微生物農藥田間防治效果[3]。微膠囊劑具有保護芯材物質免受環境影響的顯著特點，可有效防止或減弱紫外線的殺傷，從而提高殺蟲效果，延長殘效期。筆者以明膠和阿拉伯膠為壁材[4]，利用成囊技術包埋球孢白僵菌，制成微膠囊以提高菌體的穩定性、增強其耐紫外照射、延長儲存期，方便田間使用并延長田間宿存能力。

微膠囊技術是以天然或合成的高分子材料作為囊壁，通過化學法、物理法或物理化學法將活性物質囊心包裹起來，形成具有半透性或密封的囊膜的技術[5]。復凝聚法是物理化學法中相分離法的一種，它是根據天然高分子化合物在某一固定pH范圍內呈相反電性的原理，使高分子天然化合物凝積在芯材表面，從而形成雙層壁的微膠囊[6]。微膠囊粒子的大小和形狀根據具體的制備工藝不同而存在較大范圍內變化，通常制備的微膠囊粒子大小在1.00～1 000.00 μm，壁材的厚度在0.01～10.00 μm[7]。復凝聚法是制備微膠囊的重要方法之一，在國內外已有廣泛的應用和研究，主要用于醫藥、農藥、食品、肥料等領域。國內，伊可兒等[8]生產的球孢白僵菌微膠囊劑在貯藏10個月后球孢白僵菌的孢子萌發率最高達80.28%；貯藏12個月后，對馬尾松毛蟲的校正死亡率仍達66%以上。陸繼鋒等[9]采用復凝聚法制備有機磷殺蟲劑辛硫磷微膠囊，增強了囊芯的穩定性，延長了殺蟲劑的藥效。劉志強等[10]進行球孢白僵菌聚合凝膠防治玉米螟（Ostrinia nubilalis）試驗，施藥2個月后調查，仍有活性菌膠團存在，殺蟲效率達84%以上。馬麗杰等[11]和周小敏等[12]分別以殼聚糖和木質素磺酸鈉、明膠和阿拉伯膠為囊材將阿維菌素包埋成微膠囊，包埋率均超過82%。在國外，復凝聚法制備的微膠囊劑也廣泛應用于各個行業。Gu等[13]以昆蟲性信息素分子十二烷醇作為囊芯，采用復合凝聚法以明膠和阿拉伯膠作為囊壁材料制備昆蟲性信息素微膠囊。Feng等[14]探討了利用復凝聚和噴霧干燥方法制成的香料微膠囊可抑制其揮發。Hussain等[15]利用復凝聚法，選用明膠和殼聚糖作為囊皮材料，制備花椒油微膠囊，改善花椒油微膠囊的緩釋效果。Light等[16]制備梨酯微膠囊防治蘋果蠹蛾幼蟲，梨酯能吸引和誘捕蘋果蠹蛾幼蟲，同殺蟲劑協同作用能夠打亂寄主的位置并提高死亡率。目前，復凝聚法中最常見的壁材有明膠、阿拉伯膠、殼聚糖、木質素磺酸鈉、海藻酸鈉等，筆者以明膠和阿拉伯膠為壁材[4]，探討了明膠濃度、阿拉伯膠濃度、芯壁材比、pH、反應溫度和轉速等因素對復凝聚過程的影響，確定了球孢白僵菌微膠囊的制備體系，并表征了球孢白僵菌微膠囊的微觀結構，以期為開發新型微生物農藥提供理論依據。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種。球孢白僵菌（質量 500億/g）由遼寧萬恒生物制劑有限公司生產。 將菌粉過200目篩，裝瓶備用。

1.1.2試劑。明膠（SigmaAldrich公司）、阿拉伯膠（Amresco公司）、吐溫80（Amresco公司）、戊二醛（國藥集團化學試劑有限公司）和冰乙酸（國藥集團化學試劑有限公司），其余試劑購自天津廣成化學試劑有限公司；去離了水（實驗室自制）。

1.1.3儀器。電子天平（AR2130，梅特勒-托利多儀器有限公司）、磁力攪拌器（德國SLK公司）、電動攪拌器（德國 CY1L6PSNCY1L6HAN）、高速離心機（D37520，德國Osterode公司）、電子掃描顯微鏡（JSM6460LV，日本JEOL公司）、激光粒度分析儀（BT9300H，遼寧丹東百特儀器有限公司）和生物顯微鏡（奧林巴斯有限公司上海分公司）。

1.2方法

1.2.1球孢白僵菌微膠囊的制備。把球孢白僵菌菌粉配成一定濃度的菌液，加入一定量20%吐溫80，置于磁力攪拌器以400 r/min攪拌乳化，制成球孢白僵菌懸浮液，鏡檢分散均勻后加入適量明膠水溶液，溫度緩慢升至40 ℃恒溫，待體系攪拌一段時間后，將其轉入等量的阿拉伯膠水溶液中，在不斷攪拌下緩慢滴加10%醋酸溶液于混合液中，調節系統的pH至4.0左右。繼續攪拌，將體系置于冰浴中使溫度降到5～10 ℃，加入固化劑戊二醛（25%） 溶液1 ml，再用10%NaOH溶液調節pH至8.0～9.0，低溫下攪拌1 h后，取出微膠囊溶液進行離心處理，用去離子水將離心管下方的微膠囊沉淀洗滌至無戊二醛，最后得到的微膠囊室溫晾干，干燥后的物質為球孢白僵菌微膠囊粉末，4 ℃下保存。

1.2.2 球孢白僵菌微膠囊的形態特征觀察。將所制微膠囊懸浮液滴1滴到載玻片上，用光學顯微鏡觀察微膠囊的形態。在掃描電子顯微鏡樣品臺上貼一層雙面膠將微膠囊粉末輕輕撒在上面，輕輕吹去多余粉末，再進行噴金處理，利用掃描電子顯微鏡對球孢白僵菌微膠囊干粉進行電鏡掃描，觀察其外部形態特征。

1.2.3球孢白僵菌微膠囊包埋率的測定。取0.1 g菌粉配成菌懸液，測其菌數（B0），另取相同重量的菌粉所制微膠囊等體積溶液，測其菌數（B1），則包埋率=1 B1/B0[17]。

1.2.4粒徑檢測。采用BT2003型激光粒度分布儀進行測定，每個樣品測定3次。

1.2.5單因素優化微膠囊制備工藝。

1.2.5.1明膠濃度對微膠囊形成的影響。選取明膠濃度0.5%、1.0%、2.0%、3.0%和4.0%，阿拉伯膠濃度1.0%，芯壁比1∶2，成囊pH3.8，反應溫度40 ℃，攪拌速度500 r/min，反應結束后沉淀洗滌，測定包埋率，并在相同試驗條件下重復3次。

1.2.5.2阿拉伯膠濃度對微膠囊形成的影響。選取阿拉伯膠濃度0.5%、1.0%、2.0%、3.0%和4.0%，明膠濃度1.0%，芯壁比1∶2，成囊pH3.8，反應溫度40 ℃，攪拌速度500 r/min，反應結束后洗滌沉淀，測定包埋率，并在相同試驗條件下重復3次。

1.2.5.3芯壁比對微膠囊形成的影響。芯壁比選取3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3，明膠濃度1.0%，阿拉伯膠濃度1.0%，成囊pH3.8，反應溫度40 ℃，攪拌速度500 r/min，反應結束后洗滌沉淀，測定包埋率，并在相同試驗條件下重復3次。

1.2.5.4成囊pH對微膠囊形成的影響。pH選取3.4、3.6、3.8、4.0和4.2，明膠濃度1.0%，阿拉伯膠濃度1.0%，芯壁比1∶2，反應溫度40 ℃，攪拌速度500 r/min，反應結束后洗滌沉淀，測定包埋率，并在相同試驗條件下重復3次。

1.2.5.5成囊溫度對微膠囊形成的影響。反應溫度選取30、40、50、60和70 ℃，明膠濃度1.0%，阿拉伯膠濃度1.0%，芯壁比1∶2，成囊pH3.8，攪拌速度500 r/min，反應結束后洗滌沉淀，測定包埋率，并在相同試驗條件下重復3次。

1.2.5.6轉速對微膠囊形成的影響。轉速選取300、400、500、600和700 r/min，明膠濃度1.0%，阿拉伯膠濃度1.0%，芯壁比1∶2，成囊pH3.8，反應溫度40 ℃，反應結束后洗滌沉淀，測定包埋率，并在相同試驗條件下重復3次。

1.2.6正交優化微膠囊制備工藝。針對單因素影響因子的試驗結果，比較其外部形態特征、微膠囊的包埋率，選出對微膠囊包埋率影響較大的因素，將該因素作為明膠/阿拉伯膠-球孢白僵菌微膠囊的正交試驗的因素。將能夠影響試驗結果的因素再次設置不同水平，進行正交試驗以確定微膠囊的最佳制備工藝。

1.2.7 數據處理。數據均采用平均值表示，采用Excel 2003和正交設計助手Ⅱ進行分析。

2結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 明膠濃度對微膠囊形成的影響。由圖1可知，微膠囊的包埋率隨明膠濃度的增大呈先升高后下降的趨勢，在明膠濃度為1.0%時包埋率達73.93%。0.5%～4.0%明膠制成的微膠囊包埋率分別為47.08%、73.93%、68.22%、49.42%和38.13%。由此得知，低濃度明膠溶液條件下制備出的微膠囊具有較高的包埋效率，低濃度有利于物質的溶解，易分散在體系里，與阿拉伯膠反應時能防止壁材過量而造成體系黏稠，但濃度太低也不利于微膠囊的形成，低濃度不能提供足夠的電荷與阿拉伯膠反應。明膠濃度為1.0%和2.0%的微膠囊包埋率高于明膠濃度為0.5%、3.0%和4.0%的微膠囊。綜上所述，低濃度明膠的微膠囊可以提高包埋率；高濃度的明膠不利于復凝聚反應的進行，同時造成囊壁致密，厚度增大，不利于囊芯的釋放，濃度繼續加大時，微膠囊之間還易出現粘連現象。因此，明膠的濃度應控制在0.5%～2.0%范圍內。

2.1.2 阿拉伯膠濃度對微膠囊形成的影響。由圖2可知，阿拉伯膠濃度在0.5%～4.0%時制成的微膠囊包埋率分別為66.42%、73.93%、70.95%、56.40%和46.82%。隨阿拉伯膠濃度的增大球孢白僵菌微膠囊的包埋率表現為先增大后減小，在濃度為1.0%時包埋率最大。由此得知，阿拉伯膠濃度為0.5%、1.0%和2.0%所制微膠囊的包埋率高于阿拉伯膠濃度為3.0%和4.0%的微膠囊，阿拉伯膠濃度為3.0%和4.0%時，溶液黏度增大易粘連。綜上所述，阿拉伯膠濃度為0.5%～2.0%時有利于微膠囊形成。

2.1.3 芯壁比對微膠囊形成的影響。由圖3可知，隨芯壁比的增大，包埋率呈先升高后降低的趨勢，芯壁比為1∶2時微膠囊的包埋率最大為73.93%。芯壁比為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1時制成的微膠囊包埋率分別為51.94%、73.93%、69.21%、52.93%和26.07%。由此得知，芯壁比為1∶1和1∶2的微膠囊的包埋率高于芯壁比為3∶1、2∶1和1∶3的微膠囊。芯壁比過大，芯材過量會導致包埋率下降，壁材過少不能完全將芯材包覆，使得大量的囊芯粘在微膠囊表面，囊壁膜變薄。芯壁比過小，囊壁材料有大量剩余，囊壁濃度過大也易粘連，形成的囊壁變厚，不利于囊芯的釋放。

2.1.4 pH對微膠囊形成的影響。由圖4可知，在pH為3.4～4.2時制成的微膠囊包埋率分別為58.02%、66.49%、73.93%、74.45%和64.40%。pH為4.0時微膠囊的包埋率最大為74.45%。pH為3.8和4.0的微膠囊包埋率高于pH為3.4、3.6和4.2的微膠囊，這是由明膠和阿拉伯膠的性質所決定的，在水溶液中明膠分子中的正負電荷數量受介質pH的直接影響。當pH為3.6～4.2時明膠中正電荷達最大，在該條件下加入帶負電荷的阿拉伯膠溶液，此時彼此的靜電作用處于最理想狀態，明膠和阿拉伯膠產生凝聚現象而形成微膠囊[7]。當pH小于3.0時，也不能得到聚合物，這是因為在較強酸性條件下，縮聚生成的微膠囊易分解為小分子。

2.1.5 溫度對微膠囊形成的影響。由圖5可知，反應溫度在30～70 ℃時制成的微膠囊的包埋率分別為38.13%、73.93%、50.11%、35.19%和29.17%。由此得知，40和50 ℃微膠囊的包埋率高于反應溫度為30、60和70 ℃的微膠囊，反應溫度為40 ℃時包埋率最高為73.93%。綜上所述，反應溫度為40 ℃左右時有利于微膠囊形成。

2.1.6 轉速對微膠囊形成的影響。由圖6可知，微膠囊的包埋率隨轉速的增加呈先升高后降低的趨勢，轉速為500 r/min時制成的微膠囊的包埋率最大為73.93%。轉速為300～700 r/min時制成的微膠囊包埋率分別為44.49%、66.28%、73.93%、64.33%和39.51%。由此得知，攪拌速度為400和500 r/min條件下制備的微膠囊的包埋率高于攪拌速度為300、600和700 r/min條件下制備的微膠囊。表明低轉速有利于復凝聚反應的進行，高轉速易使反應體系紊亂，阻礙復凝聚反應的發生。因此，將攪拌速度控制在低轉速下即可保證反應的正常進行。

2.2正交試驗結果根據單因素試驗結果，篩選出影響微膠囊形成的主要條件，包括明膠濃度、阿拉伯膠濃度、芯壁比、成囊pH和轉速5個因素（表1），以微膠囊包埋率為指標，設計L16（45）正交試驗。由表2可知，影響包埋率的各因素主次順序為A、C、B、D、E，即明膠濃度的影響最大，其次是芯壁比，阿拉伯膠濃度、pH和轉速對包埋效果的影響都較小，最佳組合為A3C3B1D2E2，即最佳包埋工藝條件為明膠濃度1.5%、阿拉伯膠濃度0.5%、芯壁比1.0∶1.5、pH3.8、轉速450 r/min。并以上述條件制備球孢白僵菌微膠囊。

2.3球孢白僵菌微膠囊的形態特征利用光學顯微鏡與掃描電子顯微鏡對最優條件下制備的球孢白僵菌微膠囊的微觀結構和整體分布進行表征。由圖7可知，在水分散體系中，球孢白僵菌微膠囊呈球形，單分散性好，形態規則，大小較均勻。由圖8可知，球孢白僵菌微膠囊表面光滑完整，成囊性及密封性良好，雜質較少。