離子液體1—乙基—3—甲基咪唑磷酸二乙酯磷酸鹽對釀酒酵母SY101生長的影響

摘要[目的]研究離子液體1乙基3甲基咪唑磷酸二乙酯磷酸鹽（〔Emim〕DEP）對釀酒酵母SY101生長的影響。[方法]用顯微鏡觀察了不同〔Emim〕DEP濃度下液體培養基中對數生長期酵母細胞的形態及出芽情況，用分光光度法測得的數值繪制出酵母菌24 h生長曲線。[結果]試驗發現，〔Emim〕DEP對釀酒酵母SY101生長有抑制性，隨著〔Emim〕DEP濃度的增加，抑制作用越明顯。當〔Emim〕DEP濃度高于3 g/L 時，酵母菌的形態發生明顯改變；濃度高于10 g/L 時，酵母菌的出芽率明顯下降。通過平板培養測得〔Emim〕DEP對酵母菌的半有效濃度EC50值為6.67 g/L 。[結論] 研究可為由離子液體從農林廢棄物中制備納米纖維素后的殘渣發酵燃料酒精的研究提供基礎數據。

關鍵詞 離子液體〔Emim〕DEP；釀酒酵母SY101；生長影響；EC50

中圖分類號S188+.4文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）29-10299-03

基金項目海南省自然科學基金項目《TiO2/纖維素納米復合膜材料的制備及其吸附性能研究》（514218）；中國熱帶農業科學院院本級基本科研業務費專項資金項目（1630062013012）。

作者簡介王曉芳（1982- ），女，安徽定遠人，助理研究員，碩士，從事食品工程及微生物發酵方面的研究。

離子液體又稱低溫熔融鹽，作為一種新興的綠色溶劑，其巨大的應用潛力已在整個科學界達成共識[1]。納米纖維素作為功能材料，其表現出的高比表面積及高強度等優良特性，日益受到各界的廣泛關注，蘊藏著無限商機和美好的發展前景。農林廢棄物中含有大量優質纖維素[2]，是制備納米纖維素的豐富原料，且綠色環保[3]。目前從農林廢棄物中提取納米纖維素的方法有化學處理法、酶解法、生物（細菌）制備法、物理法、人工合成法[4]以及離子液體均相制備法，其中用離子液體均相法制備納米纖維素是一種工藝簡單、環境友好的納米纖維素制備方法[5]。制備納米纖維素后剩余的殘渣中仍然殘留大量的纖維素，轉換為可還原糖后可被釀酒酵母發酵生產生物乙醇，有效提高農林廢棄物綜合利用率。但離子液體對釀酒酵母生長繁殖的影響等情況鮮有報道，筆者初步研究了離子液體1乙基3甲基咪唑磷酸二乙酯磷酸鹽（〔Emim〕DEP）對釀酒酵母SY101（Saccharomyces cerevisiae SY101）生長的影響，觀察了對數生長期〔Emim〕DEP對該菌細胞的形態結構和出芽率的影響，尋找〔Emin〕DEP對釀酒酵母菌的半有效濃度（EC50），旨在為由離子液體從農林廢棄物中制備納米纖維素后的殘渣發酵燃料酒精的研究提供基礎數據。

1材料與方法

1.1供試菌株與材料試驗菌株釀酒酵母SY101（Saccharomyces cerevisiae SY101），由中國熱帶農業科學院農產品加工研究所實驗室保藏；離子液體〔Emin〕DEP由中國熱帶農業科學院農產品加工研究所實驗室制備，純度達95%；其他試劑為國產分析純。

1.2試驗方法所有試驗均重復4次，文中給出的數據為4次試驗的平均值，試驗相對誤差控制在5%以內。

1.2.1菌種培養基的制備。取保存于低溫冰箱的釀酒酵母菌株接種于100 ml（裝于250 ml錐形瓶）滅菌的液體YPD培養基中，置于恒溫振蕩培養箱30 ℃、200 r/min活化24 h，活化的菌液稀釋6倍后接種于YPD平板培養基中，置于30 ℃恒溫培養箱中培養48 h，挑取單個菌落接種于100 ml錐形瓶（容量為250 ml）液體YPD培養基中，置于振蕩恒溫箱30 ℃、振幅5 cm、轉速為200 r/min培養24 h活化。該菌液用于后續試驗中的平板培養、液體懸浮培養的菌種。該試驗過程中所用到的培養基的組成：YPD平板培養基，酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉20 g/L；YPD液體培養基，酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L。上述培養基根據需要，在其中加入適量的離子液體〔Emim〕DEP，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2〔Emin〕DEP對酵母菌SY101在平板培養基生長影響的測定。無菌操作下將上述活化后的酵母菌液10倍梯度稀釋6次（經多次涂布經驗得出稀釋6次后的效果較好）。然后吸取200 μl不同濃度的菌液均勻地涂布到含有〔Emim〕DEP濃度分別為0、0.01、0.10、1.00、3.00、5.00、10.00、12.00 g/L的YPD平板培養基，30 ℃恒溫培養48 h，觀察記錄每個平板中的菌落數（CFU）及菌落直徑。

1.2.3〔Emin〕DEP對酵母菌SY101在液體培養基生長影響的測定。同“1.2.2”，各取1.0 ml上述活化的釀酒酵母菌液無菌操作加入分別裝有不同濃度〔Emin〕DEP的99 ml YPD液體培養基的250 ml錐形瓶中，然后30 ℃、200 r/min的恒溫振蕩培養24 h。YPD液體培養基中設置〔Emin〕DEP的濃度梯度分別為0、0.01、0.10、1.00、3.00、5.00、10.00、12.00 g/L。培養過程中，間隔一定時間分別取樣（前期12 h每隔2 h，后期12 h每隔4 h）。將樣品用無菌水稀釋10倍后，以未加藥物和酵母菌的液體YPD培養基為對照，用722型分光光度計分別測定其在600 nm處的吸光度值（OD600 nm），再以培養時間（h）為橫坐標、OD600 nm為縱坐標繪制其24 h的生長曲線[6]。

2結果與分析

2.1離子液體〔Emin〕DEP對釀酒酵母SY101菌落的半效應濃度（EC50）及菌落生長直徑的影響半有效濃度（EC50）是毒性研究中的重要指標，可以比較快速地判斷被試藥物對微生物可能產生的影響，為進一步作慢性毒性研究提供依據。表1給出了不同〔Emin〕DEP的YPD平板培養基上酵母菌SY101培養48 h后的菌落形成單位數（CFU）及平均菌落直徑。由表1可知，當〔Emin〕DEP濃度高于12.00 g/L時，該酵母菌的平板上就不再出現生長菌落，且隨著〔Emin〕DEP濃度的增加，菌落數在不斷減少，單個菌落直徑也在不斷減小（圖1），這也從側面佐證了〔Emin〕DEP對該酵母菌有抑制作用，當〔Emin〕DEP濃度達到3.00 g/L時，抑制作用趨于明顯。通過對表1的數據進行擬合，得到〔Emin〕DEP對該菌的毒力回歸方程Y=2.115 6X+0.897 9，R2=0.952 1，得出〔Emin〕DEP對酵母菌SY101的半有效濃度EC50為6.67 g/L（即在平板培養時CFU數為空白對照一半所對應的〔Emin〕DEP濃度）。華中農業大學微生物學國家重點實驗室的劉洋洋等于2012年8月份發表的文章稱：當離子液體氯化1丁基3甲基咪唑〔Bmim〕Cl濃度為5.000 mg/ml時，釀酒酵母AS2.399在液體YPD培養基中的濃度為對照組的57%[7]；余培等于2013年11月份報道，1乙基3甲基咪唑醋酸鹽〔Emin〕AC對酵母菌AY93161的半有效濃度EC50為4.45 g/L[8]。與上述數據進行比較后可得出，〔Emin〕DEP對酵母菌的毒性較溫和。

2.2不同離子液體〔Emin〕DEP濃度梯度下的釀酒酵母SY101的生長曲線如圖2所示，酵母菌SY101的生長曲線隨著〔Emin〕DEP濃度的不同而變化，當〔Emin〕DEP濃度低于5.00 g/L時，酵母菌的生長曲線有著明顯的遲滯期、對數期、穩定期和衰退期；當濃度達到及高于10.00 g/L時，曲線變化不明顯，濃度達到12.00 g/L時，菌體生長被嚴重抑制，在培養基中的增幅很小。分析認為，高濃度〔Emin〕DEP抑制了該菌的生長繁殖，從而降低培養液中的菌體濃度，反映在生長曲線上則提前進入穩定期。說明〔Emin〕DEP對酵母菌的生長有抑制作用，且隨著濃度的加大，抑制作用逐步加強。

2.3離子液體〔Emin〕DEP對酵母菌SY101形態及出芽率的影響根據繪制出的酵母菌SY101在24 h內的生長曲線圖（圖2）可以直觀地看出，該酵母菌的對數生長期約在培養后的8～10 h，此時的菌體活力最佳。將上述不同濃度梯度〔Emin〕DEP培養液的對數生長期樣品于顯微鏡（粵顯牌L3200型）的40倍視野下觀察該酵母菌的細胞形態和出芽情況（圖3）。

由圖3可知，隨著〔Emin〕DEP濃度的增加，酵母菌SY101的單細胞形態逐漸由橢圓形變得圓潤，出芽率也隨之下降。當〔Emin〕DEP 濃度達到3.00 g/L時，酵母菌的單細胞形態明顯變圓，說明高濃度〔Emin〕DEP會導致該酵母菌的形態發生變化。在〔Emin〕DEP濃度達到10.00 g/L時，酵母菌的出芽率明顯下降，說明高濃度的〔Emin〕DEP會抑制該酵母菌的增殖力。由上所述，分析認為有可能是高濃度的〔Emin〕DEP引起高滲透壓，導致該酵母菌新陳代謝紊亂，影響其細胞壁的結構，從而使酵母菌活力下降。圖3不同〔Emin〕DEP濃度梯度液體YPD培養基中釀酒酵母SY101的形態和出芽情況3結論

該研究設置了單因素試驗，考察了離子液體〔Emin〕DEP對釀酒酵母SY101生長繁殖的影響，主要結論如下： ① 離子液體〔Emin〕DEP濃度低時，不會改變酵母菌單細胞的形態結構和出芽率，濃度增大時會使單細胞形態變得圓潤，該酵母菌的出芽率也會隨著〔Emin〕DEP濃度升高而降低。② 離子液體〔Emin〕DEP對釀酒酵母SY101的半有效濃度EC50為6.67 g/L。相比較于其他咪唑類離子液體（如〔Emin〕AC對釀酒酵母AY93161的半有效濃度EC50為4.45 g/L），〔Emin〕DEP對該酵母菌的毒性較小，說明〔Emin〕DEP是一種毒性較溫和的離子液體，作為溶劑從廢棄農作物纖維中提取納米纖維素后，殘留的離子液體（一般濃度會大于10 g/L）會對后續的酒精發酵產生影響，需要經過處理，降低其濃度才能接種酵母進行發酵利用。

參考文獻

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