利用POD同工酶鑒定金銀花品種及其親緣關系的研究

摘要[目的] 對6個金銀花主要栽培品種的POD同工酶進行研究，以揭示金銀花POD同工酶的變化規律。[方法]采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）對6個金銀花主要栽培品種的過氧化物酶（POD）同工酶譜進行分析。[結果]它們的POD酶譜條帶數在4～18，其中大毛花的酶譜帶數最多，達18條，紅腺忍冬最少，為4條，a2和b6可以作為這6種金銀花栽培品種共有的固有酶帶。九豐一號（3年）與大毛花的相似度指數較高（62.4），說明它們之間的親緣關系相對較近；其次是山銀花和盤葉忍冬（57.4），再次是九豐一號和紅腺忍冬（49.3）。九豐一號（3年）和紅腺忍冬的相似度指數最低（6.4），反映它們之間的親緣關系很遠。[結論] 為金銀花品種育種與鑒定提供科學依據。

關鍵詞 金銀花；過氧化物酶同工酶；品種鑒定；親緣關系

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）29-10091-03

作者簡介丁銳（1977- ），男，陜西漢中人，講師，從事資源生物開發利用研究。

金銀花（Flos lonicerae）又名金銀藤、鴛鴦藤或雙花，為忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬屬（Lonicera）植物忍冬（Lonicera japonica thunb）及同屬多種植物的干燥花蕾，是一種“藥食同源”的綠色植物，其味甘性寒，具有清熱解毒功能，是臨床常用的中藥之一[1-2]。在我國，金銀花主要分布在河南（南銀花）、山東（東銀花、濟銀花）、廣西（山銀花）、湖南、廣東、湖北、安徽、四川、浙江、陜西、江蘇、江西、貴州等地[3] 。

同工酶是基因的直接表達者。隨著對同工酶結構功能、基因表達、染色體基因定位等研究的深入，同工酶技術被成功應用于鑒定各類植物種質資源的地理起源、分類等。近年來在真菌菌種的鑒定工作中也得到了應用[4] 。其中，POD同工酶的研究利用較廣泛[4-10]。

由于金銀花在我國各地區都有廣泛種植，且其品種多樣，因此，金銀花的育種工作者往往需要引進各個地區的優良品種以培育出更加優良的品種。在引種過程中，對金銀花品種的鑒別極其重要，因為部分性狀較差的品種與某些優良品種具有形態學上的相似性，難以直接區分。不法人員則趁機以次充好，以假冒偽劣商品出售，破壞了金銀花市場秩序。筆者旨在對6個金銀花主要栽培品種的POD同工酶進行研究，以揭示金銀花POD同工酶的變化規律，為金銀花品種育種與鑒定提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料紅腺忍冬（四川）、山銀花（漢中）、九豐一號（山東）、盤葉忍冬（湖南）、雞爪花、大毛花（山東）。這6個金銀花品種均從陜西省漢中市南鄭陽春藥業公司金銀花種植基地采集。

1.2儀器高壓雙穩電泳儀（DYYⅢ4型，北京六一儀器廠），垂直電泳槽（DYYⅡ28型，櫚樣品梳 24齒，北京六一儀器廠），LGR16W 高速微量冷凍離心機（北京醫用離心機廠）。

1.3方法每個品種取幼葉約200 mg，在冰浴中制樣。提取緩沖液由1 mmol/L EDTA、10 mmol/L KCl、1 mmol/L 抗壞血酸、16.7% 蔗糖、14 mmol/L 巰基乙醇、0.1 mmol/L TrisHCl（pH7.8）組成。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度10%。醋酸-聯苯胺染色。

電泳后的凝膠，利用美國BIORAD 凝膠成像系統，對試驗結果進行處理，應用Quantity One4.1.0 軟件，選擇DICE 相似性系數、Neighbor Joining 進行聚類分析得聚類圖。

2結果與分析

2.1金銀花的過氧化物酶同工酶譜分析根據圖1～2酶帶的特點和遷移率的不同，將酶帶由負極到正極分為a、b、c 3個區，各區酶帶分別標為a1～a3、b1～b16、c1～c8，遷移率分別為0.011～0.062、0.130～0.388、0.412～0.818。6個品種的酶帶總數為 27條，各栽培品種酶帶數為4～ 18 條，帶位也有差異：大毛花的酶帶數最多（18條），紅腺忍冬的酶帶數最少（4條）；酶帶都較穩定，表現出相似的遺傳基礎，但各品種間帶位與帶數有所不同，差異主要產生在a 區和c區的某些弱帶：在a區，山銀花和九豐一號具有a1 ，而其他品種無此帶；九豐一號（3年）、雞爪花和大毛花具有a3，而其他品種無此帶，且大毛花的a3帶酶活性較強。在b區，雞爪花、大毛花和盤葉忍冬具有b3帶，且雞爪花的b3帶酶活性較弱；只有九豐一號和山銀花具有b4帶，其他品種無此帶；只有大毛花和紅腺忍冬具有b5帶；只有九豐一號和紅腺忍冬具有b9帶；九豐一號（3年）和雞爪花具有b14帶，其他品種無；九豐一號（3年）和大毛花具有b15帶。在c區，只有山銀花和盤葉忍冬具有c3帶；九豐一號（3年）和大毛花具有c4、c7、c8帶；九豐一號（3年）、雞爪花和大毛花具有c6帶。

注：1.九豐一號（3年），2.雞爪花，3.大毛花，4.九豐一號，5.山銀花，6～7.紅腺忍冬，8～9.盤葉忍冬。

此外，通過對九豐一號和九豐一號（3年）酶譜的比較可知，同一品種不同發育時期的POD同工酶譜也不同，即對于金銀花而言，其POD同工酶存在發育時期的差異。

因此，可以通過這些特征帶區別各個品種的金銀花，以利于對金銀花進行分析鑒別和遺傳育種研究。

2.2過氧化物同工酶酶譜聚類分析植物體內的同工酶在一定部位、一定發育時期，其酶譜存在相對穩定性，在一定程度上能夠反映植物個體間的遺傳差異，故同工酶作為品種遺傳性的指標之一，已廣泛應用于研究品種的起源演化及分類等方面。利用重心法系統聚類的統計手段，探討該種內品種間的親緣關系，為研究品種分類提供一些酶生物化學方面的依據[10] 。

由圖3可知，大毛花和九豐一號（3年）這2個品種的相似度最高（0.62），其親緣關系也最近，其次是山銀花和盤葉忍冬（0.56）。九豐一號和紅腺忍冬的親緣關系相對較近（0.35）。由此可將這6個金銀花品種分為3類：大毛花和九豐一號（3年）；山銀花和盤葉忍冬；九豐一號和紅腺忍冬。

圖36種金銀花品種UPGAMA 聚類從整體上看，大毛花、九豐一號和山銀花、盤葉忍冬這4個品種的親緣關系較近，這4個品種與九豐一號、紅腺忍冬的親緣關系則較遠。雞爪花與其他各品種之間的親緣關系相對較遠，但在大的范圍（圖上所示結點處）還可與大毛花、九豐一號（3年）、山銀花、盤葉忍冬分為一類，而與九豐一號、紅腺忍冬的親緣關系則相對更遠一些。

2.3譜帶相似度指數與親緣關系由于POD同工酶系基因表達的產物，也是分子水平的表現型，因此，POD同工酶的表現型差異反映了基因型的差異。從基因型差異的程度也能顯示出種間親緣關系的遠近。VAUGHAN等[11]提出以酶譜相似度預測種間親緣關系。相似度指數越高，親緣關系越近。由Vaughan公式所估算結果列于表1。

由表1可知，九豐一號（3年）與大毛花的相似度指數較高（62.4），說明它們之間的親緣關系相對較近；其次是山銀花和盤葉忍冬（57.4），再次是九豐一號和紅腺忍冬（49.3）。九豐一號（3年）和紅腺忍冬的相似度指數最低（6.4），反映了它們之間的親緣關系很遠。

該結果可能是由于結構基因在進化過程中已發生較大的變異，或由于它們的染色體組是異源的。

3小結與討論

該研究中，金銀花幼葉POD同工酶譜分為a、b、c 3區，其酶帶數分別為3、16、8。這6個金銀花栽培品種的酶帶總數為 27條，各栽培品種酶帶數為4～18 條，帶位也有差異：大毛花的酶帶數最多（18條），紅腺忍冬的酶帶數最少（4條）；酶帶都較穩定，表現出相似的遺傳基礎，但各品種間帶位與帶數有所不同，差異主要產生在a 區和c區的某些弱帶。a2和b6都可以作為這6種金銀花栽培品種共有的固有酶帶。

九豐一號（3年）與大毛花，山銀花與盤葉忍冬，九豐一號與紅腺忍冬的相似度指數都較高，說明這幾個品種之間的親緣關系相對較近。九豐一號（3年）和紅腺忍冬的相似度最低，說明這2個品種之間的親緣關系相對較遠。金銀花幼葉POD同工酶譜帶相似度分析結果，與UPGAMA聚類分析所得結果相同，說明試驗所得結果正確，且具有可重復操作性。上述結果對于鑒定金銀花品種的真偽、純度及金銀花的遺傳育種具有實際的指導意義。

九豐一號是以大毛花為親本，采用多倍體育種技術培育出的多倍體金銀花新品種，是與普通金銀花不同的四倍體植物[12]。該試驗結果表明，大毛花和九豐一號（3年）的親緣關系相對較近，但大毛花和九豐一號的親緣關系則相對較遠，不能歸于一類。

參考文獻

[1] 陳昌祥 ，王薇薇 ，倪偉，等.金銀花花蕾中的新三萜皂甙[J].云南植物研究，2000，22（2）：201-208.

[2] 金銀花[J].食品與藥品，2005（8）：74.

[3] 葛冰，盧向陽，易克，等.金銀花活性成分、藥理作用及其應用[J].中國野生植物資源，2004（5）：13-16.

[4] 蘭進，徐錦堂，王秋穎，等.靈芝過氧化物同工酶和酯酶同工酶的研究[J].中國藥學雜志，1998（12）：12-14.

[5] 李軍.不同地理種源諸葛菜的POD 同工酶分析[J].西南農業大學學報，1998，20（3）：37-39.

[6] 劉新成，劉志芳，周靖，等.豆科5 種植物的過氧化物酶同工酶的分析[J].天津師大學報：自然科學版，1999，19（2）：37-40.

[7] 辛廣，侯冬巖，劉琳琳，等.5 種東方百合過氧化物酶同工酶的分析[J].鞍山師范學院學報，2003，5 （6）：59-61.

[8] 張冬梅，劉海學，孫振雷，等.不同水稻品種過氧化物酶同工酶分析[J].哲里木畜牧學院學報，2000，10（3）：17-20.

[9] 陳紅兵，王金勝，賈俊仙.過氧化物同工酶譜帶染色條件的探討[J].生物學雜志，2003，20（4）：22-23.

[10] 卞阿娜，方份.菊花7 個品種過氧化物酶同工酶分析[J].漳州師范學院學報：自然科學版，2003，16（1）：78-81.

[11] VAUGHAN J G，DENFORD K.EAn acrylamide gel electrophoretic study of the seed proteins of Brassica，Sinapsis species with special reference to their taxonomic value[J].J Exp Bot，1968，19：724-732.