lncRNA在畜禽遺傳育種中的研究進展及應用展望

摘要長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類轉錄本長度超過200 nt的RNA分子，它們不編碼蛋白，而是以RNA的形式在表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等多種層面上調控基因的表達。對lncRNA在畜禽遺傳育種中的研究進展進行了綜述，并對lncRNA在畜禽育種中的應用進行了展望。

關鍵詞lncRNA；畜禽；育種

中圖分類號S813.3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）29-10152-03

基金項目中國博士后科學基金資助項目（2014M552004）。

作者簡介朱金龍（1986- ），男，河南許昌人，研究實習員，碩士，從事畜禽遺傳育種方面的研究。*通訊作者，講師，博士，從事生物技術與家禽育種研究。

1畜禽育種現(xiàn)狀

近半個世紀以來，隨著畜禽遺傳改良和飼料營養(yǎng)等研究技術的不斷進步，畜牧業(yè)取得了長足的發(fā)展，畜禽生長速度的加快和飼料轉化率的提高使得畜禽產(chǎn)品產(chǎn)量越來越高。然而，隨著人民生活水平的逐步提高，消費者對畜禽畜產(chǎn)品的需求不僅再停留在數(shù)量上，而對畜禽產(chǎn)品的感觀、嫩度和風味等提出了更高的要求。目前，人們對肉品質的期望與畜禽肉品質的下降之間矛盾，已成為廣大畜禽育種工作者亟待解決的實際問題之一。因此，針對畜禽肉品質的研究已成為畜禽育種工作者所重點關注的課題和畜牧科學研究的熱點之一。

畜禽肉品質是一個綜合性概念，包含滋味、嫩度及色澤等因素。肌內脂肪（Intramuscular fat，IMF）的含量與肉的嫩度呈正相關，是影響肉的風味、色澤和系水力等肉品質的重要因素，也是畜產(chǎn)品肌肉品質選育的有效指標[1]。IMF是指分布于肌肉組織中肌纖維間的脂肪，主要分布于肌外膜、肌束膜以及肌內膜上。IMF含量的增加可以降低肌肉的剪切力，進而提高肉的嫩度，使肌肉柔軟多汁。脂肪細胞的分化與脂類代謝在IMF沉積過程中起著重要作用，涉及到分化轉錄因子的調節(jié)和脂質代謝調控基因的時序表達等一系列變化[2-3]。轉錄因子的活性受到多種胞內外因子及信號通路的調控，它們的啟動對前體脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞起決定作用。

近來年，遺傳育種學家通過分子育種和轉基因等現(xiàn)代生物技術，開展了畜禽新品種（系）選育，重點開展了畜禽生長速度與肉品質性狀的選擇，在某種程度上改善了畜禽的生產(chǎn)性能。然而，對于一個生物性狀而言，它不僅受DNA水平基因的控制，而且還受mRNA水平轉錄前后的調控，且這個水平的調控更為全面、系統(tǒng)和精確。因此，如何研究發(fā)掘畜禽肌內脂肪生成的分子機制，用于指導目前畜禽育種工作，這已成為現(xiàn)代生物技術背景下畜禽育種的緊迫且關鍵任務。

2lncRNA的研究現(xiàn)狀

對“DNA元件百科全書”計劃的研究表明，人類基因組中有93%的DNA能被轉錄成RNA，且大多為非編碼RNA。2012年9月，該項目獲得了最詳細的人類基因組分析數(shù)據(jù)，證實80%的基因組以非編碼RNA形式在控制細胞、組織和器官的行為，且發(fā)揮了關鍵性的作用。這些非編碼RNA中，除了tRNA、rRNA等為人熟知外，其余大量的非編碼RNA一直被人們誤認為“垃圾序列”而未受重視。根據(jù)其長度，非編碼RNA可分為短鏈非編碼RNA（miRNA、siRNA和piRNA）和長鏈非編碼RNA（lncRNA）。lncRNA是一類本身不編碼蛋白、轉錄本長度超過200 nt的RNA分子，廣泛存在于各種生物體內，其中絕大多數(shù)由RNA聚合酶Ⅱ轉錄并經(jīng)可變剪接而來，根據(jù)其在基因組中的相對位置可將其分為正義 lncRNA、反義lncRNA、雙向lncRNA、基因內lncRNA和基因間lncRNA等5類。

長非編碼RNA（Iong non-coding RNA，lncRNA）在轉錄水平對基因表達扮演著極其重要的調控角色。lncRNA參與表觀遺傳修飾[4]、轉錄以及轉錄后等多水平的調控過程[5]。目前，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在細胞分化與增殖、生長發(fā)育[6]、器官生成[7]、免疫應答及腫瘤發(fā)生[8]等多個生命過程中均扮演著關鍵的角色。它的發(fā)現(xiàn)使人類對編碼RNA的認識揭開了新的篇章，認識到動物細胞基因調控的一種新途徑，補充了在RNA水平對靶mRNA分子進行更迅速和有效調節(jié)的認識，展現(xiàn)了細胞內基因表達調控全方位多層次的網(wǎng)絡系統(tǒng)。

近年來，全球科學家對人類基因組中l(wèi)ncRNA的調控作用開展了較大規(guī)模的研究，并取得了一些突破性進展，lncRNA相關報道如同雨后春筍般涌現(xiàn)，人們對于lncRNA的調控角色有了更進一步的認識。與miRNA相比，lncRNA在細胞內的轉錄比例更高，具有復雜而重要的生物學功能，并與復雜的生物性狀密切相關。大多數(shù)lncRNA在生物發(fā)育的某些階段產(chǎn)生，具有組織或細胞特異性，其功能涉及到胚胎發(fā)育的調節(jié)、細胞的增殖分化、器官發(fā)生、劑量補償、表觀遺傳調控和基因印記等生命活動中。

lncRNA主要通過以下3個層面實現(xiàn)對基因表達的調控：①表觀遺傳水平：通過介導染色質重構以及組蛋白修飾來調控下游基因的表達；②轉錄水平：與上游啟動子區(qū)結合，干擾下游基因的表達；③轉錄后水平：通過與編碼蛋白基因的轉錄本形成互補雙鏈，干擾mRNA的剪切或者生成內源性siRNA來調控基因的表達（見圖1）[9-10]。

注：A.lncRNA 能介導染色質重構或對其進行組蛋白修飾，從而促使異染色質的形成，抑制基因的表達；B.lncRNA 可通過多種機制調節(jié)轉錄過程；C.lncRNA 可作為轉錄因子的共激活因子調節(jié)基因轉錄；D.lncRNA可形成3 聚體復合物而干擾啟動子的作用，從而使基因表達沉默；E.反義lncRNA 能和鋅指同源盒mRNA 的5’剪切位點結合，防止內含子被剪切。

在 3 個層面上實現(xiàn)對基因表達的調控[10]現(xiàn)有研究表明，lncRNA具體的作用方式包括：①在編碼蛋白基因的上游啟動子區(qū)轉錄，從而干擾鄰近蛋白編碼基因的表達（如酵母中的SER3基因）；②抑制RNA聚合酶，或介導染色質重構和組蛋白修飾，而影響基因表達；③與編碼蛋白基因的轉錄本形成互補雙鏈，進而干擾mRNA的剪切，產(chǎn)生不同的剪切形式；④與編碼蛋白基因的轉錄本形成互補雙鏈，在Dicer酶作用下產(chǎn)生內源性的siRNA（小干擾RNA），調控基因的表達水平；⑤結合在特定蛋白質上調節(jié)相應蛋白的活性；⑥作為結構組分與蛋白質 形成 核酸蛋白質復合體；⑦結合在 特定蛋白上從而改變該蛋白的胞質定位；⑧可作為小分子RNA（如miRNA、piRNA、mascRNA）的前體分子。

此外，lncRNA與miRNA還存在互作關系，lncRNA既可以是miRNA的前體分子[11]，miRNA又可以調控lncRNA的轉錄和生成[12]。lncRNA可以誘餌的方式吸附一些特定的miRNA，影響miRNA靶基因的表達，進而發(fā)揮生物學功能，具備該作用的lncRNA也被稱為競爭性內源的RNA（Competing endogenous RNA，ceRNA）[13]。Gong等發(fā)現(xiàn)1種稱為半Stau1結合位點的lncRNA （Half-Stau1- binding site RNA，1/2-sbsRNA） 通過與mRNA的3’UTR的Alu元件的不完全配對，形成Stau1結合位點，促進Stau1與mRNA結合，導致mRNA降解[14-15]。

2.1lncRNA在肌肉發(fā)育過程中的作用目前，關于lncRNA調控肌肉發(fā)育的相關研究報道很少。Sunwoo等[16]在研究C2C12成肌細胞在分化成肌管的過程中，發(fā)現(xiàn)2個顯著上調的lncRNA：Men epsilon和Men beta，敲除這2個lncRNA會導致細胞核內RNA和蛋白的復合體的解離，表明它們是細胞核內RNA和蛋白的復合體必須組成部分，然后共同調控成肌細胞向成肌管分化。Cesana等[17]發(fā)現(xiàn)1個lncRNA（linc-MD1）可分別與miR-135及miR-133特異性結合，進而保證這二者的靶基因，即肌細胞增強因子2C（MEF2C）及決定因子樣蛋白-1（MAML1）的表達，由此對成肌纖維細胞分化產(chǎn)生顯著影響。Cabianca 等[18]發(fā)現(xiàn)1個lncRNA（DBE-T）募集蛋白Ash1L啟動組蛋白H3第36位的賴氨酸發(fā)生二甲基化使染色體發(fā)生重塑，從而導致肌營養(yǎng)不良癥的發(fā)生。這表明肌肉發(fā)育過程中均有l(wèi)ncRNA參與，并扮演著關鍵的角色。

2.2lncRNA在脂肪代謝中的調控作用Ramayo等[19]對豬的組織進行轉錄組分析，在高肌內脂肪酸組織中鑒定了270個lncRNA，而低肌內脂肪酸組織中鑒定了186個lncRNA，表明有l(wèi)ncRNA參與肌內脂肪酸形成并起著重要作用。Sun等[20]研究表明lncRNA能夠調控脂肪形成，并鑒定了175個脂肪代謝相關的lncRNA，基因組信息分析發(fā)現(xiàn)23（13%）個上調表達的lncRNA啟動子區(qū)含PPARγ結合位點，34（19%）個表達上調的lncRNA上游含CEBPα結合位點。通過RNAi來抑制10個lncRNA的表達會阻斷脂肪的形成。Pang等[21]發(fā)現(xiàn)PU.1基因的mRNA在前體脂肪細胞中高表達，但Western blot試驗證明其蛋白在前體脂肪細胞中幾乎不表達，PU.1 AS lncRNA與PU.1 mRNA形成mRNA/AS lncRNA復合物，從而阻止PU.1 mRNA的翻譯，敲低PU.1 AS lncRNA能增加PU.1 mRNA的水平，促進其翻譯，抑制脂聯(lián)素等脂肪因子的釋放，進而阻礙脂肪細胞分化。Zhang等[22]鑒定了人棕色脂肪組織中l(wèi)ncRNA的表達譜，發(fā)現(xiàn)704個上調和896個下調的lncRNA，發(fā)現(xiàn)AK003288通過調控Jph基因來影響脂肪代謝。由此可見，lncRNA在脂肪組織的形成、分化和代謝等過程中發(fā)揮著重要的作用，lncRNA的研究已成為分子生物學研究的新熱點。

3lncRNA在畜禽育種中的應用及展望

目前，lncRNA在畜禽育種中的研究報道甚少，僅有的一些研究相對于實驗動物也比較落后，畜禽育種中關于lncRNA的研究主要集中在lncRNA的發(fā)現(xiàn)與特征分析。Zhang等[22]利用測序和芯片技術分析了lncRNA在棕色脂肪組織和骨骼肌組織的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)lncRNA調控棕色脂肪細胞與骨骼肌細胞之間的分化。Huang等[23]利用牛EST數(shù)據(jù)庫鑒定了449個潛在的lncRNA，并對它們進行了序列特征分析，結果表明這些lncRNA具有組織表達特異性，GC含量低于蛋白編碼基因。Weikard等[24]通過對有色素沉著和無色素沉著的不同牛個體皮膚進行轉錄組深度測序，發(fā)現(xiàn)了10 884個未知轉錄本，4 848個經(jīng)預測具有l(wèi)ncRNA特征，其中絕大多數(shù)（4 365個）為基因間lncRNA。IGF2R為母系印跡基因，在胚胎發(fā)育中具有重要作用，其表達與1種lncRNA Airn的表達量呈正相關。Farmer等[25]研究表明在牛上也存在Airn基因，其在胚胎期的表達量逐漸增加。Rocha等利用新一代轉錄組學測序技術在牛上也發(fā)現(xiàn)了一些lncRNA。相對于lncRNA在家畜育種中的研究，lncRNA在畜禽中的研究報道更是屈指可數(shù)。Li等[26]利用深度測序技術鑒定雞骨骼肌中281個lncRNA，其保守性高于其他隨機的非編碼序列。綜上所述，目前關于動物肌肉、脂肪相關lncRNA及其對靶基因的調控研究還十分欠缺，尤其是關于lncRNA在畜禽肌肉、脂肪生長發(fā)育中的研究尚未見報道。因此，系統(tǒng)地分離克隆鑒定并從功能上研究畜禽肌肉、脂肪生長發(fā)育相關lncRNAs，探究其調控的分子機制已十分必要。

目前，關于lncRNA在畜禽主要經(jīng)濟性狀方面的研究正剛剛起步，其功能與調控機制也有待深入研究。系統(tǒng)地分離篩選與肌內脂肪生成相關lncRNA，并探究其在地方畜禽品種的優(yōu)異肉質性狀形成過程中的分子機制已十分必要和緊迫。在lncRNA-seq測序和生物信息分析篩選的肌內脂肪沉積相關lncRNA等研究基礎上，探究lncRNA在不同階段各組織中表達變化規(guī)律，進一步篩選與肌內脂肪沉積規(guī)律相關的lncRNA；利用功能獲得和功能缺失策略，從細胞水平確定對前體脂肪細胞增殖與分化有顯著差異的關鍵lncRNA，揭示lncRNA對畜禽脂肪細胞增殖與分化的生物學效應；然后，克隆關鍵lncRNA全長，利用ChIRP技術分離其靶基因，并利用RNAi試驗對靶基因進行驗證，闡明lncRNA在畜禽肌內脂肪生成過程中的分子調控機制，這對闡明重要生命現(xiàn)象的分子機理具有重要科學意義以及對畜禽肉品質的提高具有現(xiàn)實意義，并可為培育肉質優(yōu)異的地方畜禽新品系提供理論依據(jù)和新的思路。

參考文獻

[1] DRANSFIELD E，SOSNICKI A A.Relationship between muscle growth and poultry meat quality[J].Poultry Science，1999，78（5）：743-746.

[2] BOONE C，MOUROT J，GREGOIRE F，et al.The adipose conversion process：Regulation by extracellular and intracellular factors[J].Reproduction Nutrition Development，2000，40（4）：325-358.

[3] CUI H X，ZHENG M Q，LIU R R，et al.Liver dominant expression of fatty acid synthase （FAS） gene in two chicken breeds during intramuscular-fat development[J].Molecular Biology Reports，2012，39（4）：3479-3484.

[4] MATTICK J S.The genetic signatures of noncoding RNAs[J].PLoS Genetics，2009，5（4）：1000459.

[5] PLATH K，F(xiàn)ANG J，MLYNARCZYK-EVANS S K，et al.Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation[J].Science，2003，300 （5616）：131-135.

[6] CESANA M，CACCHIARELLI D，LEGNINI I，et al.A Long Noncoding RNA Controls Muscle Differentiation by Functioning as a Competing Endogenous RNA[J].Cell，2011，147（2）：358-369.

[7] KLATTENHOFF C A，SCHEUERMANN J C，SURFACE L E，et al.Braveheart，a Long Noncoding RNA Required for Cardiovascular Lineage Commitment[J].Cell，2013，152（3）：570-583.

[8] CALIN G A，LIU C，F(xiàn)ERRACIN M，et al.Ultraconserved regions encoding ncRNAs are altered in human leukemias and carcinomas[J].Cancer Cell，2007，12（3）：215-229.

[9] GUTTMAN M，RINN J L.Modular regulatory principles of large non-coding RNAs[J].Nature，2012，482（7385）：339-346.

[10] MERCER T R，DINGER M E，MATTICK J S.Long non-coding RNAs：insights into functions[J].Nature Reviews Genetics，2009，10（3）：155-159.

[11] OGAWA Y，SUN B K，LEE J T.Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways[J].Science，2008，320（5881）：1336-1341.

[12] JUAN L，WANG G，RADOVICH M，et al.Potential roles of microRNAs in regulating long intergenic noncoding RNAs[J].BMC Medical Genomics，2013，6（S1）：7.

[13] SALMENA L，POLISENO L，TAY Y，et al.A ceRNA Hypothesis：The Rosetta Stone of a Hidden RNA Language？[J].Cell，2011，146（3）：353-358.

[14] FATICA A，BOZZONI I.Long non-coding RNAs：new players in cell differentiation and development[J].Nature Reviews Genetics，2014，15（1）：7-21.

[15] GONG C G，MAQUAT L E.lncRNAs transactivate STAU1-mediated mRNA decay by duplexing with 3′ UTRs via Alu elements[J].Nature，2011，470（7333）：284-288.

[16] SUNWOO H，DINGER M E，WILUSZ J E，et al.MEN ε/β nuclear-retained non-coding RNAs are up-regulated upon muscle differentiation and are essential components of paraspeckles[J].Genome Research，2009，19（3）：347-359.

[17] CESANA M，CACCHIARELLI D，LEGNINI I，et al.A Long Noncoding RNA Controls Muscle Differentiation by Functioning as a Competing Endogenous RNA （vol 147，pg 358，2011）[J].Cell，2011，147（4）：947.

[18] CABIANCA D S，CASA V，BODEGA B，et al.A long ncRNA links copy number variation to a polycomb/trithorax epigenetic switch in FSHD muscular dystrophy[J].Cell，2012，149：819-831.

[19] RAMAYO-CALDAS Y，MACH N，ESTEVE-CODINA A，et al.Liver transcriptome profile in pigs with extreme phenotypes of intramuscular fatty acid composition[J].Bmc Genomics，2012，13：547.

[20] SUN L，GOFF L A，TRAPNELL C，et al.Long noncoding RNAs regulate adipogenesis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013，110（9）：3387-3392.

[21] PANG W J，LIN L G，XIONG Y，et al.Knockdown of PU.1 AS lncRNA Inhibits Adipogenesis Through Enhancing PU.1 mRNA Translation[J].Journal of Cellular Biochemistry，2013，114（11）：2500-2512.

[22] ZHANG J，CUI X W，SHEN Y H，et al.Distinct expression profiles of LncRNAs between brown adipose tissue and skeletal muscle[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2014，443（3）：1028-1034.

[23] HUANG W，LONG N Y，KHATIB H.Genome-wide identification and initial characterization of bovine long non-coding RNAs from EST data[J].Animal Genetics，2012，43（6）：674-682.