農(nóng)桿菌與質(zhì)粒DNA子房注射法在棉花轉(zhuǎn)基因研究中的應(yīng)用

摘 要：為了研究農(nóng)桿菌和質(zhì)粒DNA兩種子房注射法對普通棉花品種的轉(zhuǎn)化效率，以8891棉花為材料，分別在三亞和常德兩地進(jìn)行了轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。結(jié)果表明：與質(zhì)粒DNA注射相比，三亞地區(qū)農(nóng)桿菌注射的轉(zhuǎn)化效率高1.25個百分點(diǎn)；但農(nóng)桿菌子房注射的落鈴率高，獲得的種子相對較少；而在不同的地點(diǎn)試驗(yàn)，常德地區(qū)的落鈴率顯著高于三亞地區(qū)；而質(zhì)粒DNA直接注射的成鈴率更高，雖然轉(zhuǎn)化率相對較低，但也能獲得有效的轉(zhuǎn)化植株。

關(guān)鍵詞：農(nóng)桿菌子房注射；質(zhì)粒DNA子房注射；棉花；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號：Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2014）04-0031-03

Abstract： In order to study the transformation efficiency of two ovary injection methods （with Agrobacterium tumefaciens or with plasmid DNA） to normal cotton variety 8891， the transformation experiments were conducted in Sanya and Changde， respectively. The results showed that the ovary injection with Agrobacterium tumefaciens in Sanya increased the transformation efficiency by 1.25 percentage points， but it had relatively higher boll shedding rate which causing relatively less seeds， moreover， the boll shedding rate in Changde was significantly higher than that in Sanya； ovary injection with plasmid DNA had relatively higher boll setting rate， and it can obtain the effective transformation plant although the transformation efficiency was relatively lower.

Key words： ovary injection with Agrobacterium tumefaciens； ovary injection with plasmid DNA； cotton； genetic transformation

轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是目前轉(zhuǎn)基因成功并廣泛推廣種植的作物之一[1]，其種植面積已占我國棉花總種植面積的70%，超過了200萬hm2。美國孟山都公司采用經(jīng)典的根癌農(nóng)桿菌與棉花外植體共培轉(zhuǎn)化法培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種的技術(shù)路線已十分成熟[2]。但是，目前棉花的組培再生僅在Coker 310和Acala棉中獲得了成功，因此轉(zhuǎn)基因棉花品種的培育，需要先獲得轉(zhuǎn)基因的Coker 310或Acala棉，然后經(jīng)多年的雜交，才能將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)栽培種中[3-4]。這是一個漫長而效率不高的過程。

我國轉(zhuǎn)基因棉的培育通常采取花粉管通道法轉(zhuǎn)化法，又稱為質(zhì)粒DNA子房注射法（以下簡稱質(zhì)粒DNA法）。該方法將含有質(zhì)粒DNA的溶液直接注射到棉花子房中，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵細(xì)胞，并進(jìn)一步地被整合到受體細(xì)胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因的新個體[5]。郭三堆、倪萬潮等[6-7]學(xué)者先后利用該方法將蘇云金芽孢桿菌毒素蛋白基因（Bt）、豇豆胰蛋白酶抑制劑基因（CpTI） 等外源DNA導(dǎo)入到我國陸地棉品種中，成功地培育出轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種，獲得了顯著的生態(tài)、社會和經(jīng)濟(jì)效益[8]。質(zhì)粒DNA子房注射法雖然有非基因型依賴性的優(yōu)點(diǎn)，可以直接轉(zhuǎn)化任何生產(chǎn)品種，但是轉(zhuǎn)化的效率低，一般成功率僅0.1%～1.0%[9]，而且需要操作者擁有豐富的經(jīng)驗(yàn)。

農(nóng)桿菌子房注射法（以下簡稱農(nóng)桿菌法）是對傳統(tǒng)質(zhì)粒DNA子房注射法一種改良，它用農(nóng)桿菌來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的質(zhì)粒DNA[10]，利用農(nóng)桿菌在轉(zhuǎn)基因植物中拷貝數(shù)低、遺傳穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，對生產(chǎn)品種進(jìn)行直接轉(zhuǎn)化，以提高轉(zhuǎn)基因培育的整體效率。但是，在實(shí)際操作過程中發(fā)現(xiàn)，將農(nóng)桿菌直接注射到子房中容易造成棉花落鈴，轉(zhuǎn)化后種子收獲率較低。為了研究農(nóng)桿菌和質(zhì)粒DNA兩種子房注射法對普通棉花品種的轉(zhuǎn)化效率，以湘雜棉21號的母本8891為材料，分別在三亞和常德兩地進(jìn)行了轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)地概況

供試菌種有大腸桿菌（Escherichia coli）E.coli pBI121和根癌農(nóng)桿菌（A. tumefaciens）LBA4404 pBI121（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室）；供試棉花品種為湘雜棉21號的母本8891（湖南省棉花科學(xué)研究）。試驗(yàn)分別在湖南省棉花科學(xué)研究所三亞和常德的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)棉田進(jìn)行。常德試驗(yàn)地的氣候?yàn)橹衼啛釒駶櫦撅L(fēng)氣候，7～9月份高溫干旱；三亞試驗(yàn)地的氣候?yàn)闊釒Ъ撅L(fēng)氣候，12月～翌年2月份高濕清涼。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)桿菌菌液的配置 活化農(nóng)桿菌菌落LBA4404 pBI121，并在注射當(dāng)天挑取1 mm的單菌落，利用5%的蔗糖溶液將菌體稀釋到細(xì)胞個數(shù)為1×105個/mL左右；加入乙酰丁香酮（0.1 mmol/L）和Silwet L77（0.05%），充分混勻。

1.2.2 質(zhì)粒DNA提取 采用堿裂解法從工程菌株E.coli pBI121中提取質(zhì)粒DNA，并溶解在TE（pH值8.0） 緩沖液中，使DNA的質(zhì)量濃度為0.5 g/L。

1.2.3 子房注射 上午9︰00～10︰00，溫度在25～30℃之間時，于田間選取花冠顏色呈淺粉色的花朵（開花24 h左右），剝離雄蕊和花冠；然后左手托扶子房，右手持微量注射器（10 μL），將農(nóng)桿菌菌液和質(zhì)粒DNA沿花柱柱頭縱軸注入子房2/3處，注射菌液5 μL；再將微量注射器輕輕拔出至1/3處，注射另外5 μL；注射完畢，掛好標(biāo)牌，待棉花自然成熟后收獲種子。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因棉花的分子生物學(xué)檢測 利用卡那霉素對轉(zhuǎn)化植株的后代進(jìn)行苗期和田間初篩，按照DNA提取試劑盒的操作說明對初篩陽性植株進(jìn)行總DNA提取。通過GUS基因上下游引物（P1：5'-ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCC-3'，P2：5'-TCATTGTTTGCCTCCCTGCTGCGGTT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)為25μL體系：含dNTP（10 mmol/L）1 μL；10×buffer 2.5 μL；引物P1和P2（10 mmol/L）各1 μL；Tag DNA 聚合酶1 μL；加ddH2O 至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 4 min；然后94℃ 1 min；58℃ 1 min；72℃ 1 min共30個循環(huán)；72℃ 10 min。隨后對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因棉花的純合及保存 對三亞試驗(yàn)地轉(zhuǎn)基因陽性植株ZS03進(jìn)行閉花自交，利用PCR技術(shù)鑒定F2群體中單株的基因分離情況，待轉(zhuǎn)基因棉花純合后送至種子貯藏室保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)桿菌和質(zhì)粒DNA子房注射法的轉(zhuǎn)化效率

從表1中看出，農(nóng)桿菌法和質(zhì)粒DNA法兩種轉(zhuǎn)化方法在三亞、常德兩地的成鈴率分別比對照下降了59.29和52.48個百分點(diǎn)、41.69和38.47個百分點(diǎn)，說明轉(zhuǎn)化操作會對棉花的成鈴造成較大的影響。在三亞試驗(yàn)地，農(nóng)桿菌法和質(zhì)粒DNA法成鈴率分別為16.85%和23.66%；而常德試驗(yàn)地，農(nóng)桿菌和質(zhì)粒DNA注射子房法成鈴率分別為2.97%和6.19%。由此看出，常德和三亞試驗(yàn)地的質(zhì)粒DNA法的成鈴率分別比農(nóng)桿菌法的高3.22和6.81個百分點(diǎn)，說明農(nóng)桿菌直接注射對棉花成鈴的影響大于質(zhì)粒DNA法。但是從轉(zhuǎn)化效率來看，三亞試驗(yàn)地的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率比質(zhì)粒DNA 的轉(zhuǎn)化效率高1.25個百分點(diǎn)；而在常德試驗(yàn)地，兩種方法的轉(zhuǎn)化效率僅相差0.01個百分點(diǎn)?？偟膩碚f，農(nóng)桿菌法的轉(zhuǎn)化效率要稍優(yōu)于質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化效率。此外，從表1中還可看出，三亞地區(qū)的成鈴率顯著高于常德地區(qū)，其農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化效率也明顯高于常德地區(qū)，說明三亞地區(qū)更適合運(yùn)用農(nóng)桿菌法對棉花進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

2.2 F0代轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測

通過CTAB法提取F0代轉(zhuǎn)化體棉花幼葉的總DNA，條帶較清晰明亮，提取效果較好。以GUS上下游引物對轉(zhuǎn)化棉花植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測到1 800 bp的目的條帶（圖1）。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用農(nóng)桿菌法在三亞和常德分別獲得含目的基因的棉花9株和1株，而采用質(zhì)粒DNA法在三亞和常德分別獲得含目的基因的棉花8株和2株。

2.3 轉(zhuǎn)基因棉花的純合及保存

以GUS上下游引物對轉(zhuǎn)基因陽性棉花ZS03閉花自交的F2代植株進(jìn)行PCR篩選（圖2），結(jié)果顯示該單株后代均擴(kuò)增出1 800 bp左右的目的條帶。這說明該單株及其自交后代為純合轉(zhuǎn)基因植株，可繼續(xù)繁育并保存。

3 討 論

農(nóng)桿菌子房注射法是在傳統(tǒng)質(zhì)粒DNA子房注射基礎(chǔ)上建立的遺傳轉(zhuǎn)化新方法。利用微量注射器將農(nóng)桿菌沿子房縱軸方向垂直注進(jìn)子房，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化機(jī)理將外源基因?qū)爰?xì)胞實(shí)現(xiàn)對早期胚胎細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。試驗(yàn)比較了農(nóng)桿菌法和質(zhì)粒DNA法在三亞和常德兩地的轉(zhuǎn)化效果。結(jié)果表明，常德地區(qū)為中亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，棉花開花時節(jié)，天氣炎熱，氣候干燥，棉花落鈴率高，空白對照的棉花成鈴率僅為44.66%；經(jīng)農(nóng)桿菌和質(zhì)粒DNA注射后的棉花成鈴率更低，尤其是農(nóng)桿菌注射后落鈴較嚴(yán)重，成鈴率僅為2.97%。這可能與棉田的高溫適合細(xì)菌在子房中的繼續(xù)繁殖，對棉鈴產(chǎn)生毒害易使其脫落有關(guān)。在三亞地區(qū)進(jìn)行的農(nóng)桿菌子房注射法，其轉(zhuǎn)化效率高達(dá)2.54%，這與三亞的氣候條件有關(guān)。三亞試驗(yàn)區(qū)為熱帶季風(fēng)氣候，棉花開花時節(jié)，高濕清涼，溫度適宜，對照棉鈴成鈴率為76.14%，農(nóng)桿菌和質(zhì)粒DNA注射后，棉花成鈴率也分別達(dá)到了16.85%和23.66%。這說明三亞的氣候條件適宜進(jìn)行農(nóng)桿菌子房注射。

農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化落鈴率高，尤其是在常德地區(qū)，高溫有利于細(xì)菌的繼續(xù)增殖對棉鈴產(chǎn)生毒害，與質(zhì)粒DNA法相比沒有優(yōu)勢。質(zhì)粒DNA的直接注射雖然轉(zhuǎn)化效率稍低于農(nóng)桿菌法，但能獲得更多的種子，從中也能篩選出一定的轉(zhuǎn)化植株。不管質(zhì)粒DNA法還是農(nóng)桿菌法都可在三亞地區(qū)進(jìn)行，這說明除了轉(zhuǎn)化方法外，在活體上進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時對外界環(huán)境的要求也較高。

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（責(zé)任編輯：成 平）