農桿菌與質粒DNA子房注射法在棉花轉基因研究中的應用

摘 要：為了研究農桿菌和質粒DNA兩種子房注射法對普通棉花品種的轉化效率，以8891棉花為材料，分別在三亞和常德兩地進行了轉化試驗。結果表明：與質粒DNA注射相比，三亞地區(qū)農桿菌注射的轉化效率高1.25個百分點；但農桿菌子房注射的落鈴率高，獲得的種子相對較少；而在不同的地點試驗，常德地區(qū)的落鈴率顯著高于三亞地區(qū)；而質粒DNA直接注射的成鈴率更高，雖然轉化率相對較低，但也能獲得有效的轉化植株。

關鍵詞：農桿菌子房注射；質粒DNA子房注射；棉花；遺傳轉化

中圖分類號：Q789 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2014）04-0031-03

Abstract： In order to study the transformation efficiency of two ovary injection methods （with Agrobacterium tumefaciens or with plasmid DNA） to normal cotton variety 8891， the transformation experiments were conducted in Sanya and Changde， respectively. The results showed that the ovary injection with Agrobacterium tumefaciens in Sanya increased the transformation efficiency by 1.25 percentage points， but it had relatively higher boll shedding rate which causing relatively less seeds， moreover， the boll shedding rate in Changde was significantly higher than that in Sanya； ovary injection with plasmid DNA had relatively higher boll setting rate， and it can obtain the effective transformation plant although the transformation efficiency was relatively lower.

Key words： ovary injection with Agrobacterium tumefaciens； ovary injection with plasmid DNA； cotton； genetic transformation

轉基因抗蟲棉是目前轉基因成功并廣泛推廣種植的作物之一[1]，其種植面積已占我國棉花總種植面積的70%，超過了200萬hm2。美國孟山都公司采用經典的根癌農桿菌與棉花外植體共培轉化法培育轉基因抗蟲棉新品種的技術路線已十分成熟[2]。但是，目前棉花的組培再生僅在Coker 310和Acala棉中獲得了成功，因此轉基因棉花品種的培育，需要先獲得轉基因的Coker 310或Acala棉，然后經多年的雜交，才能將目標基因轉移到生產栽培種中[3-4]。這是一個漫長而效率不高的過程。

我國轉基因棉的培育通常采取花粉管通道法轉化法，又稱為質粒DNA子房注射法（以下簡稱質粒DNA法）。該方法將含有質粒DNA的溶液直接注射到棉花子房中，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵細胞，并進一步地被整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉基因的新個體[5]。郭三堆、倪萬潮等[6-7]學者先后利用該方法將蘇云金芽孢桿菌毒素蛋白基因（Bt）、豇豆胰蛋白酶抑制劑基因（CpTI） 等外源DNA導入到我國陸地棉品種中，成功地培育出轉基因抗蟲棉新品種，獲得了顯著的生態(tài)、社會和經濟效益[8]。質粒DNA子房注射法雖然有非基因型依賴性的優(yōu)點，可以直接轉化任何生產品種，但是轉化的效率低，一般成功率僅0.1%～1.0%[9]，而且需要操作者擁有豐富的經驗。

農桿菌子房注射法（以下簡稱農桿菌法）是對傳統(tǒng)質粒DNA子房注射法一種改良，它用農桿菌來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的質粒DNA[10]，利用農桿菌在轉基因植物中拷貝數(shù)低、遺傳穩(wěn)定性好等優(yōu)點，對生產品種進行直接轉化，以提高轉基因培育的整體效率。但是，在實際操作過程中發(fā)現(xiàn)，將農桿菌直接注射到子房中容易造成棉花落鈴，轉化后種子收獲率較低。為了研究農桿菌和質粒DNA兩種子房注射法對普通棉花品種的轉化效率，以湘雜棉21號的母本8891為材料，分別在三亞和常德兩地進行了轉化試驗。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗地概況

供試菌種有大腸桿菌（Escherichia coli）E.coli pBI121和根癌農桿菌（A. tumefaciens）LBA4404 pBI121（湖南農業(yè)大學細胞生物學實驗室）；供試棉花品種為湘雜棉21號的母本8891（湖南省棉花科學研究）。試驗分別在湖南省棉花科學研究所三亞和常德的轉基因實驗棉田進行。常德試驗地的氣候為中亞熱帶濕潤季風氣候，7～9月份高溫干旱；三亞試驗地的氣候為熱帶季風氣候，12月～翌年2月份高濕清涼。

1.2 試驗方法

1.2.1 農桿菌菌液的配置 活化農桿菌菌落LBA4404 pBI121，并在注射當天挑取1 mm的單菌落，利用5%的蔗糖溶液將菌體稀釋到細胞個數(shù)為1×105個/mL左右；加入乙酰丁香酮（0.1 mmol/L）和Silwet L77（0.05%），充分混勻。

1.2.2 質粒DNA提取 采用堿裂解法從工程菌株E.coli pBI121中提取質粒DNA，并溶解在TE（pH值8.0） 緩沖液中，使DNA的質量濃度為0.5 g/L。

1.2.3 子房注射 上午9︰00～10︰00，溫度在25～30℃之間時，于田間選取花冠顏色呈淺粉色的花朵（開花24 h左右），剝離雄蕊和花冠；然后左手托扶子房，右手持微量注射器（10 μL），將農桿菌菌液和質粒DNA沿花柱柱頭縱軸注入子房2/3處，注射菌液5 μL；再將微量注射器輕輕拔出至1/3處，注射另外5 μL；注射完畢，掛好標牌，待棉花自然成熟后收獲種子。

1.2.4 轉基因棉花的分子生物學檢測 利用卡那霉素對轉化植株的后代進行苗期和田間初篩，按照DNA提取試劑盒的操作說明對初篩陽性植株進行總DNA提取。通過GUS基因上下游引物（P1：5'-ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCC-3'，P2：5'-TCATTGTTTGCCTCCCTGCTGCGGTT-3'）進行PCR擴增。PCR反應為25μL體系：含dNTP（10 mmol/L）1 μL；10×buffer 2.5 μL；引物P1和P2（10 mmol/L）各1 μL；Tag DNA 聚合酶1 μL；加ddH2O 至25 μL。反應程序為：95℃ 4 min；然后94℃ 1 min；58℃ 1 min；72℃ 1 min共30個循環(huán)；72℃ 10 min。隨后對PCR 產物進行凝膠電泳分析。

1.2.5 轉基因棉花的純合及保存 對三亞試驗地轉基因陽性植株ZS03進行閉花自交，利用PCR技術鑒定F2群體中單株的基因分離情況，待轉基因棉花純合后送至種子貯藏室保存。

2 結果與分析

2.1 農桿菌和質粒DNA子房注射法的轉化效率

從表1中看出，農桿菌法和質粒DNA法兩種轉化方法在三亞、常德兩地的成鈴率分別比對照下降了59.29和52.48個百分點、41.69和38.47個百分點，說明轉化操作會對棉花的成鈴造成較大的影響。在三亞試驗地，農桿菌法和質粒DNA法成鈴率分別為16.85%和23.66%；而常德試驗地，農桿菌和質粒DNA注射子房法成鈴率分別為2.97%和6.19%。由此看出，常德和三亞試驗地的質粒DNA法的成鈴率分別比農桿菌法的高3.22和6.81個百分點，說明農桿菌直接注射對棉花成鈴的影響大于質粒DNA法。但是從轉化效率來看，三亞試驗地的農桿菌轉化效率比質粒DNA 的轉化效率高1.25個百分點；而在常德試驗地，兩種方法的轉化效率僅相差0.01個百分點。總的來說，農桿菌法的轉化效率要稍優(yōu)于質粒DNA的轉化效率。此外，從表1中還可看出，三亞地區(qū)的成鈴率顯著高于常德地區(qū)，其農桿菌轉化法的轉化效率也明顯高于常德地區(qū)，說明三亞地區(qū)更適合運用農桿菌法對棉花進行遺傳轉化。

2.2 F0代轉化植株的PCR檢測

通過CTAB法提取F0代轉化體棉花幼葉的總DNA，條帶較清晰明亮，提取效果較好。以GUS上下游引物對轉化棉花植株進行PCR擴增，檢測到1 800 bp的目的條帶（圖1）。檢測結果發(fā)現(xiàn)，采用農桿菌法在三亞和常德分別獲得含目的基因的棉花9株和1株，而采用質粒DNA法在三亞和常德分別獲得含目的基因的棉花8株和2株。

2.3 轉基因棉花的純合及保存

以GUS上下游引物對轉基因陽性棉花ZS03閉花自交的F2代植株進行PCR篩選（圖2），結果顯示該單株后代均擴增出1 800 bp左右的目的條帶。這說明該單株及其自交后代為純合轉基因植株，可繼續(xù)繁育并保存。

3 討 論

農桿菌子房注射法是在傳統(tǒng)質粒DNA子房注射基礎上建立的遺傳轉化新方法。利用微量注射器將農桿菌沿子房縱軸方向垂直注進子房，通過農桿菌轉化機理將外源基因導入細胞實現(xiàn)對早期胚胎細胞的轉化。試驗比較了農桿菌法和質粒DNA法在三亞和常德兩地的轉化效果。結果表明，常德地區(qū)為中亞熱帶濕潤季風氣候，棉花開花時節(jié)，天氣炎熱，氣候干燥，棉花落鈴率高，空白對照的棉花成鈴率僅為44.66%；經農桿菌和質粒DNA注射后的棉花成鈴率更低，尤其是農桿菌注射后落鈴較嚴重，成鈴率僅為2.97%。這可能與棉田的高溫適合細菌在子房中的繼續(xù)繁殖，對棉鈴產生毒害易使其脫落有關。在三亞地區(qū)進行的農桿菌子房注射法，其轉化效率高達2.54%，這與三亞的氣候條件有關。三亞試驗區(qū)為熱帶季風氣候，棉花開花時節(jié)，高濕清涼，溫度適宜，對照棉鈴成鈴率為76.14%，農桿菌和質粒DNA注射后，棉花成鈴率也分別達到了16.85%和23.66%。這說明三亞的氣候條件適宜進行農桿菌子房注射。

農桿菌的轉化落鈴率高，尤其是在常德地區(qū)，高溫有利于細菌的繼續(xù)增殖對棉鈴產生毒害，與質粒DNA法相比沒有優(yōu)勢。質粒DNA的直接注射雖然轉化效率稍低于農桿菌法，但能獲得更多的種子，從中也能篩選出一定的轉化植株。不管質粒DNA法還是農桿菌法都可在三亞地區(qū)進行，這說明除了轉化方法外，在活體上進行遺傳轉化時對外界環(huán)境的要求也較高。

參考文獻：

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（責任編輯：成 平）