真菌生物膜耐藥機制與防治研究進展

[摘要] 真菌已成為醫院獲得性感染的重要病原體，在抗真菌治療過程中耐藥性真菌的增加引起醫學界廣泛關注，真菌生物膜的發現和其在真菌耐藥性中發揮的作用引起學者廣泛的重視，真菌生物膜耐藥與防治研究不斷進入新領域。該文旨在闡明真菌生物膜的重要性，從生物膜的胞外機制、外排泵基因表達以及藥物靶點的基因變異幾個方面來闡述真菌生物膜的耐藥機制，總結真菌生物膜病防治的最新研究進展。

[關鍵詞] 真菌；生物膜；耐藥機制

[中圖分類號] R379 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2014）09（c）-0197-02

由于臨床廣譜抗菌藥物治療、器官移植、免疫抑制劑治療、內置醫療器材治療、放化療以及艾滋病等免疫缺陷性疾病流行使得真菌感染的發病率呈上升趨勢，由于效率低下的診斷方法和不恰當的初始抗真菌治療使真菌感染死亡率高達45%[1]。真菌感染分離的真菌性病原微中白假絲酵母菌感染所占比例55%以上，甚至有報道高達66.7%[2-3]，真菌耐藥性發生是臨床抗真菌治療效果不佳的重要原因，已證實病原真菌生物膜的形成是真菌產生耐藥性重要因素之一[4]，臨床上大約有65%的感染與微生物在組織、器官或醫療設備表面形成生物膜有關。該文從常見致病菌生物膜的形成的結構及影響因素、生物膜可能的耐藥機制以及真菌生物膜病的防治方法等幾個方面進行綜述，闡明當前臨床對真菌生物膜耐藥機制與防治研究進展。

1 生物膜的結構及影響因素

1.1 生物膜的結構

生物膜是真菌形成菌落的生存方式，Chandra等通過激光掃描共聚焦顯微鏡對白色念珠菌生物膜超微結構觀察發現生物膜（biofilm）是微生物群落為了自我保護而產生的一種可黏附組織表面由其自身產生的細胞外聚合物基質（ECM）包裹的三維結構菌細胞群體，對生物膜形成過程分進行詳細觀察后將其形成過程分為早、中、晚3 個階段[5-6]。

1.2 生物膜形成的影響因素

生物膜的形成受包括宿主的免疫狀態、營養成分、藥物以及生長環境的物理、化學因素等多種因素影響。孫秋寧等研究發現血清及組織液有增加念珠菌粘附于生物材料表面的作用，能夠明顯增加生物膜念珠菌活性，可以促進生物膜形成[7]。

早在2002年就有研究報道白色念珠菌可以分泌一種容量感應分子法尼醇可以抑制白色念珠菌生成菌絲從而控制細胞增殖避免過量細胞造成的營養競爭， 同時促使菌體游離形成新生物膜，在生物膜形成中起重要作用[8]。

2 生物膜的耐藥機制

2.1 生物膜的屏障作用

細胞外聚合物基質（ECM）是組成生物被膜結構的基質物主要由碳水化合物、蛋白質等成分組成。 碳水化合物中的主要組成部分β-1，3葡聚糖由位于細胞膜中β-1，3葡聚糖合成酶催化合成，β-1，3葡聚糖能螯合唑類抗真菌藥物的被稱為“藥物海綿”，能夠吸附大量抗真菌藥物從而延遲藥物滲入起到物理屏障作用，是白念珠菌生物膜耐藥的重要原因[9]。

2.2 生物膜外排泵基因及相關表達

真菌基因組研究證實真菌基因組中轉運蛋白編碼基因所表達的蛋白產物中ATP 結合盒（ABC）轉運蛋白超家族和主要易化子超家族（MFS）是真菌主要轉運蛋白超家族。ABC 轉運蛋白超家族是一種ATP 結合型轉運蛋白包括五個蛋白家族，是主要外排蛋白，被命名為多藥耐藥家族（MDR）、多藥耐藥相關蛋白家族（MRP）和多效性耐藥家族（PDRI）的3個蛋白家族與胞內毒性物質的外排密切相關[10]。MFS 轉運蛋白其中兩個家族，與外排毒性物質功能相關。ABC和MFS的高表達可引起多種抗真菌藥特別是三唑類抗真菌藥物交叉耐藥[11]。Mukherjee 等通過建立基因缺失的菌株模型和檢測藥物外排泵的功能實驗證實外排泵僅在生物膜形成早期在相關耐藥性中起著重要作用[12]。

2.3 藥物靶點基因變異

抗真菌藥物作用機理大致可分為3種：①與真菌細胞膜成分結合破壞細胞膜完整性，如多烯類；②抑制關鍵酶活性，阻止細胞壁或細胞膜成分合成，如烯丙胺類、氮唑類和棘白菌素類；③干擾有絲分裂和DNA合成，如嘧啶類、抗生素類。臨床常見感染性真菌對多烯類藥物如兩性霉素B耐藥非常罕見，耐藥性研究較少，學術界普遍認為真菌對多烯類藥物內要可能存在3種假說[13-14]：①兩性霉素B穿過真菌細胞壁通路發生改變；②細胞膜中脂類發生改變，兩性霉素B與細胞膜結合機率降低了；③真菌細胞對兩性霉素B藥物作用敏感性降低。有文獻報道通過體外誘導使ERG3基因突變使細胞膜中麥角固醇合成障礙導致兩性霉素B耐藥[15]。平滑假絲酵母CgERG6基因的突變促進假菌絲的生長是平滑假絲酵母耐藥株對多烯類藥物敏感性降低的原因。臨床分離的烯丙胺類耐藥菌株較少，對耐藥株的角鯊烯環氧化酶編碼基因（SE）進行測序分析發現1個氨基酸L393F突變，可能是其產生耐藥性的原因。氮唑類抗真菌藥物耐藥的原因是編碼其作用靶酶羊毛甾醇14α-去甲基化酶的ERG11基因變異或過度表達。棘白菌素類是由于編碼β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶的FKS1和/或FKS2基因點突變，導致真菌對脂肽類抗菌藥物的敏感性明顯降低。

真菌對氟胞嘧啶原發性耐藥很低（<2%），繼發性耐藥依賴與嘧啶藥物作用不同靶酶的失活：①真菌通過編碼胞嘧啶通透酶的基因fcy2點突變，影響藥物的吸收降低細胞內藥物積累。②編碼胞嘧啶脫氨酶基因fcy1或編碼尿嘧啶磷酸核糖轉移酶基因fur1的點突變也可以導致獲得性氟胞嘧啶耐藥。這些酶催化5-氟胞嘧啶轉化為5-氟尿苷一磷酸，使藥物反起作用。最常見的獲得性耐藥氟胞嘧啶是基于fur1基因點突變。

3 真菌生物膜病的防治

3.1 傳統藥物防治

采取聯合使用藥物的治療策略，例如兩性霉素B與氟胞嘧啶，氟胞嘧啶與氟康唑，兩性霉素B與氟胞嘧啶，卡泊芬凈與脂質體兩性霉素B，卡泊芬凈與氟康唑等的聯合用藥，使藥物協同抗菌作用發揮療效。

開發抗真菌藥物的新劑型，如兩性霉素B脂質體，兩性霉素B脂質復合物，兩性霉素B膠體分散體，伊曲康唑，和β-環糊精伊曲康唑等新劑型，藥物新機型對真菌生物膜作用明顯但作用機理尚不清楚。

3.2 新藥物開發

3.2.1 天然植物提取 植物中含有大量的生物活性分子，精油的主要成分是植物提取物，其對不同微生物的具有較強的抗菌活性，在這方面萜烯、香芹酚、香葉醇、和麝香草酚在白色念珠菌感染醫療設備的防治中的作用已被證實。另外，萜類化合物具有優良的抗白念珠菌酵母和菌絲形式生長活性且對HeLa細胞無毒。因此，在不久的將來萜類化合物可能不僅作為一種抗真菌藥物單獨使用還可以協同常規藥物如氟康唑用于抗真菌治療。鐘羅楓等人通過體外培養白色念珠菌生物膜，在生物膜生成不同階段給予紫檀芪證實其對白色念珠菌生物膜具有顯著抑制作用。

3.2.2 人工合成 菌藥物的第2個來源包括非聚合合成劑，可分為四組。第1組是一類以N，N-二甲雙胍復合物為基礎的化學制品，由于這些化合物顯示出較低的細胞毒性，因此可作為潛在的廣譜抗生素。第2組是一類傳統抗真菌藥物結構的衍生化合物，其中一些比原來的結構有著更好的抗菌作用。第3組是由合成的肽類物質組成的，即“人乳鐵蛋白衍生肽”，其在臨床前期試驗和臨床試驗有著很好的耐受性。最后一組是半合成天然產物的衍生物，如棘白菌素衍生物，米卡芬凈鈉，阿尼芬凈，乙酸卡泊芬凈和紐莫康定。這些改進的藥物在某些性能上優于初始的天然產物。可惜的是，棘白菌素衍生物的口服給藥時吸收差，因此僅用于靜脈注射。在白色念珠菌的治療上，一種可以與醋酸卡泊芬凈媲美的天然的抗真菌成分已經分離出來。這種成分被命名為綠原酸擬肽，是一種新的抑制（1，3）-β-D-葡聚糖合成酶的三萜糖苷。從綠原酸擬肽衍生的幾種合成產品，目前正在開發中，以優化在體內的抗真菌活性和口服療效。

3.3 中草藥應用

在抗真菌治療中傳統中藥不良反應小、標本兼治的優勢逐步顯現出來，具有獨特的抗菌機制和提高機體免疫力的作用。汪長中等人通過制作念珠菌的生物膜， 不同生長時期給予中藥，發現穿心蓮內醋、黃芩苷對的生物膜具有較強的抑制作用。 許穎等人研究發現五倍子煎液對初期階段的白念珠菌生物膜具有抑制作用。目前已發現近300種中草藥如姜黃油、山蒼子油、大蒜、太子參、白術、黃茂、土模皮、大黃等具有較強的抗真菌的作用，并能有效抑制菌的生物膜形成。

4 結語

雖然隨著真菌生物膜形成機理和耐藥機制的研究不斷深入，研究學者不斷發現新的抗真菌藥物和治療方法，但是由于體內外的差異性和耐藥性菌株的不斷出現，臨床在真菌感染的防治任然面臨巨大的挑戰，需要不斷的研究和探討。

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（收稿日期：2014-06-22）