殺菌/滲透增強蛋白基因轉染小鼠受到大腸桿菌攻擊后結腸粘膜上皮離子轉運的變化機制

摘要：目的 殺菌通透性增加蛋白嵌合基因（BPI700-Fcγ1700）轉染的小鼠，給予感染最小致死劑量（MLD）的大腸桿菌，觀察和探究結腸上皮電阻和離子轉運的變化和機制。方法 利用基因轉染、短路電流記錄、ELISA測定技術，記錄轉基因小鼠結腸粘膜的基礎電流、電壓以及給予促分泌物對上皮離子轉運的影響。結果 基因轉染小鼠與對照組相比，結腸上皮基礎電阻和短路電流明顯增加，在上皮的頂膜側加入鈉離子通道阻斷劑阿米洛利后，則可以明顯抑制增加的電阻；應用上皮離子促分泌物forskolin后，可以明顯增加結腸上皮的短路電流，這種短路電流可以被氯離子通道阻斷劑DPC、Na+-K+-2Cl-共轉運體抑制劑bumetanide明顯抑制；并且forskolin作用結腸粘膜后上皮cAMP的含量明顯高于對照組。結論 基因轉染小鼠結腸上皮陰離子轉運明顯增加，從而促進了腸道排毒反應，這可能是轉基因小鼠對致死性大腸桿菌抵抗力增加的原因之一。本研究為革蘭氏陰性菌感染的研究和治療提供了理論基礎。

關鍵詞：殺菌/滲透增強蛋白；結腸；上皮；離子轉運；短路電流

革蘭氏陰性菌感染可以導致嚴重的病理變化，其引起的敗血癥和休克導致死亡率逐年增加[1，2]。常規的抗生素、抗炎癥因子等治療手段由于耐藥、不能中和內毒素等原因，在臨床上不能獲得滿意的療效。找到能夠中和內毒素、殺菌效果顯著的藥物變的非常迫切。殺菌/滲透增強蛋白（BPI）在1978年首次被發現，BPI及其重組功能片段經過臨床研究證實，具有殺滅細菌和中和內毒素的功能，但是因為半衰期短、生物利用度低等原因，在臨床應用上具有很大的限制。

鑒于以上情形，我們構建了殺菌/滲透增強蛋白的一種功能片段--BPI700-Fcγ1700。發現其有較高的生物利用度，并且可以明顯增加對大腸桿菌感染的抵抗力，遭受感染的動物存活率明顯增加，提示此種功能片段具有很好的潛在應用價值。眾所周知，腸道組織容易遭受致病性大腸桿菌的侵襲，我們先期發現BPI700-Fcγ1700在腸道組織有廣泛表達[3，4]。那么在結腸上皮BPI700-Fcγ1700對離子轉運有何影響？機制如何？為了回答這些問題，我們對BPI700-Fcγ1700基因轉染小鼠進行了大腸桿菌的感染，應用短路電流記錄技術等方法，檢測結腸上皮離子轉運與粘膜屏障的變化，探究其抗感染能力的機理，為革蘭氏陰性菌感染的預防和治療手段的開發提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 動物 BALB /c雄性小鼠（6周齡， 15～20 g） 45只，隨機分組，按照實驗動物福利委員會許可，動物在室溫條件下，正常晝夜更替的光照，24h食水供應，直至試驗之日。動物來源于首都醫科大學動物科學部，國家等級動物飼養場。

1.2 用于測量短路電流的組織制備 小鼠遠端結腸粘膜標本制備：用頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，迅速從直腸淋巴結向上取約4cm遠端結腸（該淋巴結通常位于直腸向上約3 cm處）。沿腸系膜縱向切開，用通有95%氧和5%二氧化碳的冰K-HS（Krebs-Henseleit）溶液將組織的粘膜面沖洗干凈，用頂端精細的鑷子，在解剖顯微鏡下，小心將粘膜下層﹑肌層和漿膜層與粘膜層鈍性分離，得到一薄層組織，包括上皮層和一些粘連的結締組織，大鼠遠端結腸粘膜標本即制備完成。

1.3 主要試劑 主要試劑：阿米洛利、forskolin、DPC均為Sigma化學公司（St. Louis，MO）產品，均溶于二甲基亞砜。預實驗表明，溶劑不改變基本的電生理參數。

1.4 基因轉染鼠的制備 請參考我們先前發表的文獻[4，5]。

1.5 短路電流測定技術 本實驗采用恒溫灌流裝置體外測量短路電流，將結腸粘膜標本置于灌流裝置的Ussing小室中。跨粘膜電位差由一對電壓敏感電極測得，該電極前端插入Ussing小室靠近組織的電極插孔中，后端連接到前置放大器，并與電壓鉗儀器連接，儀器的輸出連接到圖表記錄儀，記錄測量結果。測量前，將儀器調零，消除兩電壓電極的電位差和溶液的電阻。用電壓鉗將上皮固定在零電位，使組織短路，此時測得跨上皮電流為短路電流。每隔25s，自動施以-0.1 mV的電壓脈沖（ΔVt）刺激，觀察膜電流變化（ΔIt），根據歐姆定律Rt=ΔVt/ΔIt， 計算膜電阻（Rt）。刺激前后跨膜電流的改變以粘膜單位面積通過的電流（μA*cm-2）為校準，以電流面積（μA*min）的形式表現。

1.6 cAMP的測定 取遠端結腸粘膜標本，將其置于37℃通有5% CO2和95% O2的K-HS溶液中孵育；每樣品稱重約150 mg。在500 ml K-HS液中孵育平衡30 min后，以觀察藥物對胞內cAMP水平變化的影響；經藥物處理后，迅速將組織取出，在濾紙上吸取出多余水份，再置于液氮中迅速冷凍；測定時將組織在冰上勻漿后并離心 （10620×g， 5 min）。細胞內cAMP含量的測定由商業化的ELISA試劑盒完成（華英生物技術有限公司，北京，中國）

1.7 統計學分析 實驗開始時，先測定結腸粘膜的基礎電壓（potential difference，PD）﹑跨膜電阻（transepithelial resistance，TR）以及基礎電流（basal current，BC），加藥后觀察ISC的變化，單位為μA*cm-2。應用GraphPad Prism 4.0軟件進行統計處理，數據以\"均數 ± 標準誤\" （means ± S.E.M.）表示。

2結果

2.1 結腸上皮基礎電生理學特征的測定 見圖1，BPI700-Fcγ1700 基因轉染組（gene-transferred），兩組對照鼠（PBS control和（EGFP control）都有基礎的跨膜電壓（PD） （見圖1A）， 電流（ISC） （見圖1B）， 以及電阻（Rt） （見圖1C）。轉基因小鼠表現出更高的PD （3.1 ± 0.3 mV， n=30， P<0.01 ）， ISC （81.3 ± 2.6 μA/cm2， n=30 P<0.01） 和Rt （38.6 ± 3.8 Ω·cm2， n=30， P<0.05）。

為了闡明轉基因小鼠基礎短路電流增加的機制，在結腸粘膜的頂膜側加入上皮鈉離子通道（ENaC）的阻斷劑阿米洛利（10 μM），結果表明基礎電流由81.3 ± 2 ？滋A/cm2 降到55.4 ± 2？滋A/cm2 （n = 9， P<0.01）；而兩個對照組則沒有明顯變化。結果提示ENaC參與了轉基因小鼠基礎電流的形成。

2.2 Forskolin對結腸粘膜的作用 為了比較轉基因鼠與對照組對促分泌物的影響有何差異，應用forskolin （10 μM）觀察對結腸粘膜的作用。結果表明forskolin使轉基因組的短路電流水平由81.3 ± 2？滋A/cm2 增加到 175.4 ± 5？滋A/cm2 （n = 7， P<0.01），顯著高于對照組。應用Cl-通道阻斷劑DPC可以明顯抑制 forskolin引起的短路電流，從175.4 ± 5 到 91 ± 3？滋A/cm2 （見圖2A， n = 7， P< 0.01） ， Na+-K+-2Cl-共轉運體抑制劑bumetanide （100？滋M）也有類似作用（見圖2B）。

這些結果提示促分泌物更能促進轉基因鼠而不是對照組的陰離子分泌，這可能是轉基因鼠更有助于排除傷害性物質的原因之一。

2.3 cAMP依賴性信號參與轉基因小鼠的結腸上皮離子轉運 應用ELISA方法測定結腸上皮cAMP的含量。轉基因鼠的基礎含量為106.3 ± 18 pmol·mg-1 ，對照組分別為112± 7.2pmol·mg-1 和100.3 ± 4.09 pmol·mg-1 （n = 6）。應用forskolin后，轉基因組cAMP含量增加到 256.5 ± 17 pmol·mg-1 ；而對照組的變化明顯小于實驗組。

3討論

我們先前發現，經過致死性大腸桿菌攻擊后，殺菌-滲透增強蛋白基因轉染小鼠的存活率明顯增高，但伴有腹瀉，其腸道粘膜的離子轉運變化不明，機制不清。短路電流記錄技術逐步地應用于胃腸道粘膜上皮離子轉運的研究，我們應用此種技術記錄不同組別小鼠的電生理學特征。發現轉基因小鼠有更大的基礎電阻、電流，并且在刺激物的作用下有更為明顯的促進陰離子分泌的作用。

腸道上皮Cl-通道在水鹽代謝中扮演重要角色[6， 7]，其正常的離子轉運對維持生理功能和穩態不可或缺。在大量影響因子或者傷害性因素的侵襲下，轉基因小鼠的結腸粘膜可以產生更大量的Cl-分泌以及電阻增加，從而促使血液或腸道上皮細胞中更多物質排到腸腔中，減輕有毒物質如細菌、病毒等對機體的傷害。我們發現轉基因小鼠被forskolin促分泌效應刺激后，可以產生更多的cAMP，表明轉基因小鼠之所以表現電阻增加、更明顯的促陰離子分泌作用，是可能通過cAMP信號通路來完成的。

根據我們先前的研究結果以及結合文獻報道[8]，與對照組相比，轉基因小鼠對促分泌物forskolin的刺激更為敏感，氯離子的分泌更為顯著，并且伴有上皮鈉離子通道ENaC活動的增加。這些成為其抗感染能力增加的主要機理之一。

本實驗第一次證實殺菌-滲透增強蛋白基因轉染小鼠能夠增加結腸上皮的電阻以及cAMP依賴性的離子轉運，從而增加粘膜屏障功能，促進腸道毒素排除，改善受感染小鼠的存活率。本研究為革蘭氏陰性菌感染的預防和治療提供了實驗依據。

參考文獻：

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[8]Feng XY， Li Y， Li LS，et al. Dopamine D1 receptors mediate dopamine-induced duodenal epithelial ion transport in rats[J].Transl Res，2013，161： 486-494.

編輯/王海靜