結腸癌組織中IGF—1亞型和Ki—67表達水平探討

[摘要] 目的 探討結腸癌組織中IGF-1及其亞型和Ki-67在結腸癌（CRC）組織中表達的意義及相關性。方法 以確診CRC的80例患者為研究對象，術中收集腫瘤及非腫瘤組織制備標本并分別歸入觀察組與對照組。行免疫組化法評估IGF-1及其亞型蛋白和Ki-67抗原的表達。統計分析兩者表達與臨床資料間的關系。 結果 ①觀察組IGF-1、IGF-1A、IGF-1B蛋白及Ki-67抗原表達的標志指數（LI）顯著高于對照組（P<0.05），但IGF-1C蛋白表達LI無顯著差異；IFG-1與IGF-1A表達呈正相關、與Ki-67呈負相關，IGF-1B及IGF-1C與Ki-67呈正相關，上述相關性有統計學意義（P<0.05），未見其他顯著相關性。②IGF-1及其亞型的表達與患者年齡呈正相關；IGF-1C及Ki-67的表達與腫瘤分化程度呈負相關；IGF其亞型和Ki-67的表達與Dukes分期呈正相關；Ki-67表達與淋巴結轉移呈正相關。上述相關性均有統計學意義（P<0.05），未見其他顯著相關性。 結論 IGF-1亞型與Ki-67的表達存在一定相關性，而Ki-67表達上調與結腸癌的發展有關，因此調控IGF-1基因表達可成為結腸癌治療的新靶點。

[關鍵詞] IGF-1；IGF-1亞型；Ki-67；結腸癌；免疫組織化學

[中圖分類號] R735.35 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）36-0013-03

The discussion of expression level of IGF-1 subtypes and Ki-67 in colorectal cancer tissues

SONG Hui YANG Zhiwei

Department of Emergency， Bao'an People's Hospital of Shenzhen City， Shenzhen 518101， China

[Abstract] Objective To discuss the expression meaning and correlation of IGF-1 subtypes and Ki-67 in colorectal cancer （CRC） tissues. Methods Eighty cases of patients with a definite diagnosis of CRC were selected as the research objects， tumor and non tumor tissue specimens of intraoperative collection were prepared and were divided into observation group and control group. The expression of the subtypes of IGF-1 protein and Ki-67 antigen were assessed by immunohistochemistry method. The relationship between expression and clinical data were statistically analyzed. Results ①IGF-1， IGF-1A， IGF-1B protein and Ki-67 antigen expression index（LI） of observation group were significantly higher than those of control group （P<0.05），but there was no significant difference in IGF-1C protein expression of LI； IFG-1 and IGF-1A expression had positive correlation， negative correlation with Ki-67， IGF-1B IGF-1C and Ki-67 had positive correlation， the correlations above were statistically significant（P<0.05）， there were no other significant correlations. ②The expression of IGF-1 and its subtypes had positive correlation with patient ages； IGF-1C and Ki-67 expression had negative correlation with tumor differentiation degree； Expression of IGF subtypes， Ki-67 and Dukes stages were positively correlated； The expression of Ki-67 was positively correlated with lymph node metastasis. The correlations above were statistically significant （P<0.05）， there were no other significant correlations. Conclusion There are correlations between the IGF-1 subtypes and the expression of Ki-67， The Ki-67 expression up is related to the development of colorectal cancer， therefore regulating and controling IGF-1 gene expression may become a new target treatment for colorectal cancer.

[Key words] IGF-1；IGF-1 subtype； Ki-67；Colorectal cancer； Immunohistochemistry

目前對腫瘤的研究已深入到分子學水平，取得的主要成果已可以有效地預測腫瘤的發展及治療效果，如Ki-67可協助判斷腫瘤的良惡性及惡性程度，亦是判斷各種臨床因素與患者預后的有效指標[1]，且部分研究已證實其高表達與結腸癌（CRC）腫瘤細胞的分化程度、Dukes分期有關[2]，但單獨控制該因子對疾病的治療并無顯著效果，提示還需尋找到其他相關因子。近期有研究指出IGF-1及其亞型濃度與CRC風險存在一定相關性，然不同資料結果差異較大[3]。基于此，本研究應用免疫組化法全面分析了IGF-1亞型（IGF-1A、IGF-1B、IGF-1C）與Ki-67表達及臨床資料間的關系，以期尋找影響結腸癌發展的危險因子，為預防結腸癌的發展提供新的治療靶點，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取2013年2月～2014年5月間就診于我院普外科并確診CRC的患者，共80例。所有患者均進行手術治療，男女比例53∶27，年齡37～82歲，平均（55.8±6.2）歲；病程1周～19個月，平均（6.8±1.1）個月；癌癥原發病灶位置：升結腸、橫結腸、降結腸、乙狀結腸比例38∶5∶17∶20；淋巴結轉移者31例；癌癥分型：管狀腺癌、黏液腺癌、低分化腺癌、混合型癌比例52∶8∶9∶11。術中取結腸癌腫瘤組織標本納入觀察組；取腫瘤部位到黏膜下層15 cm組織標本納入對照組。

1.2 納入標準

術前未予其他輔助性治療；知情同意；病歷資料完整；經病理診斷確證。

1.3 檢測方法

1.3.1 主要試劑 兔抗人IGF-1、IGF-1A、IGF-1B、IGF-1C單克隆抗體，鼠抗人Ki-67單克隆抗體，DAB顯色試劑盒、SP試劑盒。上述試劑均購自北京中衫金橋生物有限公司。

1.3.2 免疫組化法 采用SP方法，陽性對照為已知標準陽性切片，陰性對照以PBS代替一抗。其他步驟嚴格參照試劑盒。流程如下：所有實驗標本均經10%中性甲醛固定、石蠟包埋。行連續切片，片厚2 μm，以第一張HE染色切片做指示，其余備用。置入65℃環境下烤片后，行二甲苯脫蠟，并行酒精梯度脫水。處理完畢后，行抗原修復，滴入pH6.0檸檬酸鹽修復液，置入微波爐煮沸5 min，室溫冷卻。20 min后以2%雙氧水溶液處理15 min。隨后以pH7.4的0.01 M PBS緩沖液洗5 min，連續3次。處理完畢后加入一抗，室溫孵育，持續2 h，隨后再以PBS緩沖液洗5 min，連續3次。行二抗室溫孵育，持續30 min，隨后再以PBS緩沖液洗5 min，連續3次。行DAB顯色，持續5 min。定量測試切片不復染，定性觀察切片復染。統計陽性表達情況，行對比分析。

1.3.3 結果判定 IGF-1及其亞型細胞陽性：細胞質明顯著色或強色；Ki-67細胞陽性：腫瘤細胞核棕褐色染。計算標志指數（LI）=（陽性細胞數/1000個腫瘤細胞）×100%，每個標本選擇10個高倍視野，取平均值。

1.4 觀察指標

統計IGF-1及其亞型蛋白、Ki-67抗體表達情況，并分析表達間的相關性；統計患者年齡（具體數據）、性別（男1，女0）、腫瘤分化情況（高中低分別為3、2、1）、Dukes分期（A、B、C、D分別為1、2、3、4）、淋巴結轉移情況（有1，無0），并分析其與各蛋白表達的相關性。

1.5 統計學方法

應用SPSS 19.0統計學軟件處理數據，計量資料以均數±標準差表示，行t檢驗，相關性分析行Spearman相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察組與對照組IGF-1亞型及Ki-67表達對比

觀察組IGF-1、IGF-1A、IGF-1B蛋白及Ki-67抗原的表達均顯著性高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；IGF-1C則差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 觀察組與對照組IGF-1亞型及Ki-67表達對比（x±s，%）

2.2 IGF-1及其亞型、Ki-67蛋白表達的相關性分析

IGF-1及三種亞型均與Ki-67蛋白的表達存在一定相關性，其中IGF-1及IGF-1A與其表現出顯著負相關性，IGF-1B及IGF-1C與其表現出顯著正相關性。另IGF-1與IGF-1A間相互正相關。Spearman相關性分析提示并無其他顯著相關性，見表2。

表2 IGF-1及其亞型、Ki-67蛋白表達的相關性分析（r，P）

2.3 IGF-1及其亞型、Ki-67蛋白表達與臨床病理參數相關性分析

IGF-1及其亞型、Ki-67蛋白的表達與CRC臨床病理間存在一定相關性：IGF-1及其亞型的表達與患者年齡呈正相關；IGF-1C及Ki-67的表達與腫瘤分化程度呈正相關；IGF其亞型和Ki-67的表達與Dukes分期呈正相關；Ki-67的表達與淋巴結轉移呈正相關。Spearman相關性分析提示并無其他顯著相關性，見表3。

表3 IGF-1及其亞型、Ki-67蛋白表達與臨床病理相關性分析（r，P）

3 討論

為探明腫瘤標志物及其對癌癥的影響，科研人員進行了不懈的努力。有研究顯示定位于第10號染色體的Ki-67基因可能與多種腫瘤的出現及發展有關。該基因調控生成Ki-67抗原，多大量表達于增殖期細胞，有助于評估細胞增殖，在何曉彬等關于結腸癌的研究中，其表達與癌癥發生率呈正相關[4]。有研究指出，其與結腸癌患者的年齡、性別、Dukes分期及分化程度等重要臨床信息存在顯著相關性[5]，本研究除在性別方面存在歧義外，亦可支持該論點。性別方面的原因可能與樣本量有關。雖然此結論也能有效應用于多種癌癥預后的評價，但考慮到CRC的致癌因素多、基因檢測困難，且CRC腫瘤形成于遺傳變化有一定關聯，我們認為還需要從遺傳物質的改變及表觀、遺傳改變的累及上探尋更廣泛的腫瘤標志物。

既往有研究指出，IGF系統在部分腫瘤中發揮著重要作用，且IGF-1血清濃度越高、IGF結合蛋白3血清濃度越低，結腸癌等的風險越高，許峰等的研究能夠直接證實血清IGF-1與肺癌的進展情況有一定相關性[6]，考慮到癌癥的通性，此相關性可能亦可見于CRC患者。但亦有研究指出，血清IGF-1僅與癌癥風險呈相對弱的正相關性[7]，因此能否應用IGF-1評價CRC風險還具有一定的爭議性。

本研究則直接證實了IGF-1蛋白的表達與CRC的發展沒有顯著關聯，但亦可證實，其亞型因子的表達可有效預測CRC的發展，是值得關注的研究方向。本研究表明，在癌變組織及癌變周邊組織中，IGF-1、IGF-1A、IGF-1B蛋白及Ki-67抗原的表達差異顯著，癌變組織中陽性表達量顯著高于對照組。為進一步驗證IGF-1及其亞型與Ki-67蛋白表達的相關性，本研究對各相關因子的表達行Spearman相關性分析，結果顯示，IGF-1及IGF-1A與Ki-67抗原的表達呈顯著負相關，IGF-1B及IGF-1C與Ki-67抗原的表達呈顯著正相關，另IGF-1與IGF-1A間呈相互正相關。這說明各因子的表達可能存在更深層的相關機制，尚需進一步研究。

本研究同時指出，IGF-1的各種亞型均與腫瘤Dukes分期呈正相關，且IGF-1C與腫瘤的分化程度也存在一定的負相關聯系，且IGF-1及其亞型與Ki-67的表達也存在一定的相關性。IGF-1為肽生長因子，生理作用主要為刺激細胞生長，可表現為激活細胞增殖、抑制細胞凋亡，因此可能與腫瘤細胞的異常增殖有關[8]。IGF-1和IGF-1A均與整合素α5β1的超表達有關，可抑制細胞轉移[9]，本研究已驗證兩者與Ki-67的表達呈負相關；IGF-1B及IGF-1C則能夠刺激細胞遷移侵襲[10]，本研究亦證實了兩者與Ki-67呈正相關。

總之，本研究首先驗證了既往認為可通過檢測Ki-67評價腫瘤預后及發展的論點，同時以其為基礎，證明了IGF-1及其亞型在結腸癌組織表達中的價值。我們認為調控IGF-1基因表達可能成為結腸癌治療的新靶點。

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（收稿日期：2014-10-21）