過(guò)表達(dá)Pitx3基因慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及穩(wěn)定細(xì)胞株的建立

摘要：目的 構(gòu)建并包裝大鼠Pitx3基因過(guò)表達(dá)慢病毒并建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Pitx3基因的MES23.5 多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞株。方法 采用RT-PCR方法擴(kuò)增Pitx3基因片段并將其連接于含有嘌呤霉素抗性的Plv-cs2.0-N-FLAG載體質(zhì)粒，采用慢病毒包裝四質(zhì)粒系統(tǒng)（pRRE/pVSVS/pREV/pLV），用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000將四質(zhì)粒按一定比例轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；收集慢病毒上清并感染MES23.5細(xì)胞株，嘌呤霉素穩(wěn)定表達(dá)Pitx3的MES23.5細(xì)胞株，Western blotting檢測(cè)Pitx3蛋白的表達(dá)。結(jié)果 限制性?xún)?nèi)切酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明在900bp處有一明顯條帶； Pitx3測(cè)序結(jié)果顯示序列與gene bank上的序列完全一致；嘌呤霉素篩選病毒感染的MES23.5細(xì)胞，傳代篩選第5代后細(xì)胞幾乎無(wú)死亡現(xiàn)象；Western blotting結(jié)果顯示，在分子量為43kDa處有相應(yīng)條帶。結(jié)論 成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)Pitx3基因的慢病毒表達(dá)載體并建立了穩(wěn)定表達(dá)Pitx3基因的MES23.5細(xì)胞株，此研究為進(jìn)一步探討Pitx3基因的功能提供了良好的研究工具。

關(guān)鍵詞：Pitx3；慢病毒；載體構(gòu)建；過(guò)表達(dá)

帕金森病（Parkinson Disease，PD）是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床癥狀為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、動(dòng)作減少和自主活動(dòng)障礙等，主要的病理特征是中腦黑質(zhì)多巴胺（Dopamine，DA）能神經(jīng)細(xì)胞的慢性進(jìn)行性變性死亡。膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子GDNF對(duì)受損的黑質(zhì)DA能神經(jīng)細(xì)胞具有很好的保護(hù)作用，如何促進(jìn)內(nèi)源性GDNF表達(dá)的增加是當(dāng)前PD治療的研究熱點(diǎn)[1，2]。

轉(zhuǎn)錄因子Pitx3屬于垂體同源盒家族成員，最初發(fā)現(xiàn)在發(fā)育中的骨骼肌和眼晶狀體中有表達(dá)，隨著研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)其在中腦黑質(zhì)致密部和腹側(cè)被蓋區(qū)高表達(dá)[3，4]。Pitx3是維持黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)細(xì)胞存活必需的因子，在DA能神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。……