過表達Pitx3基因慢病毒表達載體的構建及穩定細胞株的建立

摘要：目的 構建并包裝大鼠Pitx3基因過表達慢病毒并建立穩定過表達Pitx3基因的MES23.5 多巴胺能神經細胞株。方法 采用RT-PCR方法擴增Pitx3基因片段并將其連接于含有嘌呤霉素抗性的Plv-cs2.0-N-FLAG載體質粒，采用慢病毒包裝四質粒系統（pRRE/pVSVS/pREV/pLV），用轉染試劑Lipofectamine 2000將四質粒按一定比例轉染293T細胞；收集慢病毒上清并感染MES23.5細胞株，嘌呤霉素穩定表達Pitx3的MES23.5細胞株，Western blotting檢測Pitx3蛋白的表達。結果 限制性內切酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳結果表明在900bp處有一明顯條帶； Pitx3測序結果顯示序列與gene bank上的序列完全一致；嘌呤霉素篩選病毒感染的MES23.5細胞，傳代篩選第5代后細胞幾乎無死亡現象；Western blotting結果顯示，在分子量為43kDa處有相應條帶。結論 成功構建過表達Pitx3基因的慢病毒表達載體并建立了穩定表達Pitx3基因的MES23.5細胞株，此研究為進一步探討Pitx3基因的功能提供了良好的研究工具。

關鍵詞：Pitx3；慢病毒；載體構建；過表達

帕金森病（Parkinson Disease，PD）是一種常見的中樞神經系統退行性疾病，主要臨床癥狀為靜止性震顫、肌強直、動作減少和自主活動障礙等，主要的病理特征是中腦黑質多巴胺（Dopamine，DA）能神經細胞的慢性進行性變性死亡。膠質細胞系源性神經營養因子GDNF對受損的黑質DA能神經細胞具有很好的保護作用，如何促進內源性GDNF表達的增加是當前PD治療的研究熱點[1，2]。

轉錄因子Pitx3屬于垂體同源盒家族成員，最初發現在發育中的骨骼肌和眼晶狀體中有表達，隨著研究的進展，發現其在中腦黑質致密部和腹側被蓋區高表達[3，4]。Pitx3是維持黑質致密部DA能神經細胞存活必需的因子，在DA能神經細胞的生長和分化過程中發揮著重要的作用。Pitx3缺失的小鼠出生后，中腦腹側DA能神經細胞減少，并且小鼠的運動能力下降[5，6]。培養的SH-SY5Y細胞系及小鼠腹側中腦原代細胞中分別過表達Pitx3，均能夠明顯上調GDNF的表達量[7]。然而Pitx3調控GDNF表達的機制是什么，目前尚未見報道。鑒于此，本研究中我們利用基因工程技術構建了Pitx3過表達的慢病毒，并篩選出過表達Pitx3基因的穩定細胞株，為后續研究Pitx3調控GDNF功能奠定了很好的實驗基礎。

1資料與方法

1.1質粒、菌株、細胞株、試劑 目的基因：Pitx3，908bp，NM_019247.1。載體質粒為pLV-CS2.0-N-Flag（抗性：嘌呤+8821bp），293T細胞株、DH5α感受態，均由廈門大學生科院陳瑞川教授饋贈。小量和中量質粒抽提試劑盒購自QIAGEN公司、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA Marker、限制性內切酶EcoRⅠ、SalⅠ及T4DNA Ligase均購自NEB公司。DNA引物合成和DNA片段測序由上海生工生物工程有限公司完成。DMEM培養基，胎牛血清FBS，購自Gibco公司。胰蛋白酶Trypsin 0.125%EDTA購自SIGMA公司。DA能神經細胞MES23.5購自中國科學院上海細胞所。細胞培養所用培養基為含10% FBS的DMEM培養基，于37℃含5% CO2的培養箱中培養。Pitx3抗體購自SIGMA公司。

1.2攜帶Pitx3的慢病毒載體pLV-N-Flag-Pitx3的構建 收集培養的細胞，Trizol法提取總RNA。利用Pitx3的引物（PITX3 Forward： 5'-GCGGAATTCATGGAGTTTGGGCTGCTTGGTG；PITX3 Reverse： 5'-GCGGTCGACTCAACACTGGCCGTTCCACG；下劃線分別代表酶切位點EcoRⅠ及SalⅠ） 擴增目的基因Pitx3。將擴增好的Pitx3基因和空載體質粒pLV-CS2.0-N-Flag分別用EcoRⅠ及SalⅠ37℃雙酶切3 h后，瓊脂糖凝膠電泳分別回收酶切產物。將回收的酶切后的目的片段和載體質粒進行連接反應，并轉化DH5α感受態細菌。次日挑取單菌落接種于含5ml，100μg/ml Ampicillin抗性的LB培養液中，250rpm，37℃恒溫搖床培養過夜，用小量質粒抽提試劑盒抽提質粒，并用EcoRⅠ及SalⅠ酶切鑒定，酶切鑒定正確的重組克隆進行測序驗證。

1.3慢病毒pLV-N-Flag-Pitx3的包裝 采用含10%FBS的DMEM培養基培養293T細胞，細胞密度生長至50%～60% 時用于病毒的轉染。將上述成功連接目的基因的載體質粒pLV-CS2.0-N-Flag和包裝質粒pRRE/pVSVG/pREV按照2：1：1：1的比例，利用Lipofectamine 2000轉染進293T細胞內；轉染后的第3d收集細胞培養基，并換上新鮮的培養基；第4d再次收集細胞培養基，將兩次收集的上清混勻。將上述培養基1000 rpm離心5 min，棄去細胞碎片，上清液利用孔徑為0.45μm的PVDF濾器過濾至50ml離心管中。再次進行離心（4℃、50000 rpm高速離心），小心棄去上清液并晾干，按100 ul/10cm培養皿的量加入DMEM（不含血清、雙抗）重懸病毒沉淀，室溫靜置2 h，然后用移液器輕輕地吹勻（避免產生氣泡），繼續室溫放置30min，按每次使用的病毒量分裝到潔凈的1.5ml EP管中，-80℃冰箱保存。

1.4慢病毒pLV-N-Flag-Pitx3生物學滴度測定 在滴度測定的前1d取一塊96孔板，按照每孔1×105細胞的密度接種293T細胞。加polybrene到新鮮的完全培養基中，使其終濃度為8μg/ml。用含有polybrene的完全培養基10倍梯度稀釋病毒；各吸取10μl病毒稀釋液到相對應的96孔板中，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養過夜，8h后用新鮮的完全培養基換液，繼續于培養箱培養96 h后，用熒光顯微鏡計數熒光細胞數量。一般情況下，在最高稀梯度10m的孔數出現N（N<10）個帶熒光的細胞，則病毒滴度為N×10m×100 TU/ml（10m為稀釋倍數）。

1.5蛋白免疫印跡法（Western Blotting） 培養的正常和過表達Pitx3的穩定細胞株，利用碧云天公司生產的蛋白裂解液裂解收集的細胞，并BCA法測定蛋白濃度，最后樣品置于100℃變性10min，離心備用。處理好的樣品經SDS-PAGE凝膠進行蛋白電泳、轉膜、封閉和抗體孵育，最后置于Odyssey儀器掃描觀察結果。

1.6慢病毒pLV-N-Flag-Pitx3感染靶細胞后Pitx3蛋白表達鑒定及穩定細胞株的篩選 采用含10% FBS的DMEM培養基培養MES23.5細胞，待細胞密度生長至50%～60%時進行靶細胞感染。采用MOI值為10感染MES23.5細胞，感染72 h后，用含有終濃度為1.5 ug/ml嘌呤霉素的培養基傳代篩選能夠穩定表達Pitx3的細胞株，凍存備用。繼續傳代穩定細胞株，收集細胞western blotting方法檢測Pitx3蛋白的過表達。

1.7統計分析 統計學分析采用多因素方差分析，P<0.05被認為差異具有顯著意義。

2結果

2.1成功構建慢病毒pLV-N-Flag-Pitx3質粒 瓊脂糖凝膠電泳鑒定RT-PCR結果，發現在約900bp和9000bp處分別有明顯的基因片段；構建出慢病毒pLV-N-Flag-Pitx3質粒，用EcoRⅠ及SalⅠ酶切鑒定，結果顯示在約900bp及9000bp處分別有兩條明亮的條帶；將上述酶切鑒定正確的重組克隆進行測序驗證，測序結果經Blast驗證，發現基因克隆完全正確，無點突變和缺失（圖1）。

圖1 PCR產物及雙酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳圖

M： Marker； 1：質粒經EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切產物； 2：PCR產物。

2.2成功包裝制備慢病毒pLV-N-Flag-Pitx3及穩定細胞株的制備 將構建好的慢病毒載體質粒pLV-N-Flag-Pitx3與包裝質粒一起轉染293T細胞，熒光顯微鏡下觀察GFP的表達。轉染24 h后細胞內可見綠色熒光表達，48 h時細胞綠色熒光表達明 顯。慢病毒pLV-GFP-Pitx3的生物學滴度檢測為3.0×107 TU/ml（圖2）。

圖2 病毒上清滴度稀釋后轉染293T細胞的熒光圖片

A：病毒上清稀釋100倍； B：病毒上清稀釋102倍； C：病毒上清稀釋103倍；D：病毒上清稀釋104倍；E：病毒上清稀釋104倍；F：病毒上清稀釋105倍。

將上述慢病毒pLV-N-Flag-Pitx3和對照病毒pLV-N-GFP感染MES23.5細胞，感染48h后可見GFP熒光表達，72 h后熒光強度顯著增強。pLV-GFP-Pitx3慢病毒按感染復數（MOI）10的感染效率較高，且細胞形態正常，死亡率較低，感染率為50%～60%。感染72 h后，細胞用含有嘌呤霉素的培養基傳代培養，傳代最初發現細胞死亡比較多，待傳代5代以后細胞幾乎無死亡現象，表明剩余的細胞均是含有嘌呤抗性的細胞，穩定表達Pitx3的MES23.5細胞株已經被成功篩選。

2.3 Pitx3表達量的鑒定 收集培養的穩定表達Pitx3基因的細胞和對照組的MES23.5細胞，Western Blotting結果顯示在43kDa 處有相應的條帶，并且過表達細胞株中的Pitx3表達顯著高于對照組細胞中的表達（圖3）。

圖3 Western Blotting結果顯示Pitx3蛋白表達的圖片

Control：正常的細胞； pLV： 空病毒對照組； pLV-Pitx3： 過表達Pitx3的實驗組

3結論

為了后續探討轉錄因子Pitx3促進內源性GDNF的表達的機制，在此研究中我們構建并篩選了穩定過表達Pitx3基因的MES23.5細胞系。首先我們構建了攜帶Pitx3基因的慢病毒載體質粒，質粒經限制性內切酶酶切結果顯示在900bp和9000bp的條帶處分別有兩條明顯的條帶，這一結果表明我們成功將目的基因和慢病毒載體成功連接，測序結果也進一步證實了構建的堿基序列完全正確。然后我們將構建好的載體質粒和包裝質粒共轉染293T細胞48h時，細胞內熒光顯著表達，表明載體質粒和包裝質粒通過整合形成了完整的病毒。故我們選擇在轉染48h和64h時收集轉染的上清，因為上清中包含分泌出的病毒顆粒。最后我們將上述病毒上清感染MES23.5細胞，72h時可見熒光顯著表達，說明包裝的病毒是具有感染能力的病毒，能夠很好的感染MES23.5。因為此時細胞的感染效率只有50%左右，而載體質粒本身攜帶有嘌呤霉素抗性的基因，所以利用含有嘌呤霉素的培養基篩選除了穩定過表達Pitx3的MES23.5細胞。Western blotting結果進一步顯示目的基因Pitx3在細胞內成功獲得了高表達。

綜上所述，我們成功構建并包裝了過表達Pitx3基因的慢病毒，并篩選出了穩定表達Pitx3基因的MES23.5細胞株，為進一步研究Pitx3調控GDNF表達的機制奠定了很好的理論基礎。

參考文獻：

[1]Redmond， D.E.， Jr.， et al.， Comparison of fetal mesencepFlaglic grafts， AAV-delivered GDNF， and both combined in an MPTP-induced nonhuman primate Parkinson's model[J]. Mol Ther， 2013，21（12）：2160-2168.

[2]Yue， X.Comparative study of the neurotrophic effects elicited by VEGF-B and GDNF in preclinical in vivo models of Parkinson's disease[J].Neuroscience， 2014，258：385-400.

[3]Veenvliet， J.V..Specification of dopaminergic subsets involves interplay of En1 and Pitx3[J]. Development， 2013，140（16）：3373-3384.

[4]Kleven， G.A.Prenatal ontogeny of the dopamine-dependent neurobeFlagvioral phenotype in Pitx3-deficient mice[J].Eur J Neurosci，2013，37（10）：1564-1572.

[5]Luk， K.C.The transcription factor Pitx3 is expressed selectively in midbrain dopaminergic neurons susceptible to neurodegenerative stress[J].J Neurochem，2013，125（6）：932-943.

[6]Smidt， M.P.， et al.， Early developmental failure of substantia nigra dopamine neurons in mice lacking the homeodomain gene Pitx3[J].Development， 2004，131（5）：1145-55.

[7]Peng， C.， et al.， Overexpression of pitx3 upregulates expression of BDNF and GDNF in SH-SY5Y cells and primary ventral mesencepFlaglic cultures[J].FEBS Lett， 2007，581（7）：1357-61.

編輯/申磊