食品檢測中培養基的質量控制

摘要：培養基的制備和使用是微生物實驗室檢測工作的重要環節，培養基自身質量的優劣、保存條件、環境是否得當、配置使用的正確與否直接影響到培養基的質量從而影響到檢測結果的準確性、可靠性，可見培養基是檢測工作的基礎自80年代以來，微生物培養基專業在研究開發、制造和應用等領域發展迅速，尤其是干燥培養基以其便利、實用和高效，得到使用者的認可。但國內該行業生產工藝的設備較落后，對產品的分析手段也不完善，成品培養基質量參差不齊，影響了使用效果，因此本文對目前微生物檢測中培養基的購置、制備、貯存和使用過程中的關鍵點，從培養基的配置、水化、滅菌、接種、性能測試等方面應采取的措施進行探討，以提高和完善實驗室中培養基的質控水平。

關鍵詞：微生物檢測；質量控制；培養基

隨著生物技術的迅速發展，微生物對醫藥衛生、臨床檢驗、實驗動物及食品、化妝品、工農業、環保等眾多領域發揮著越來越重要的作用。由于各類微生物有著不同的營養要求以及對微生物培養的各自工作目的，促進了微生物培養基的研究、生產、使用技術的不斷改進。雖然國家標準GB/T4789.1-4889.31-2003中對檢驗中所用的培養基、配置方法作了具體規定，但在實際的實驗室檢測工作中還存在著許多復雜因素，忽視這些因素很可能給檢測結果帶來偏差，甚至錯誤，從而無法正確評價被測樣品的微生物污染狀況。本文結合在微生物檢測中針對培養基的配置及使用過程中的實踐經驗、操作方法、質量控制等措施談一些觀點和看法，希望有利于微生物檢側工作更好地開展[1]。

1培養基的分類

1.1固體培養基 固體培養基是在培養基中加入凝固劑，有瓊脂、明膠、硅膠等，常用于微生物分離、鑒定、計數和菌種保存等方面，實驗室中常用的有營養瓊脂、麥康凱、TCBS等。

1.2液體培養基 液體培養基中不加任何凝固劑。這種培養基的成分均勻，微生物能充分接觸和利用培養基中的養料，實驗室中常用的有生理鹽水、肉湯培養基、致病菌的各類增菌液。

1.3半固體培養基 半固體培養基是在液體培養基中加入少量凝固劑而呈半固體狀態。可用于觀察細菌的運動、鑒定菌種和測定噬菌體的效價，實驗室中常用的有保存菌種的半固體。

2培養基的購置與驗收

購置：從培養基自身的質量來看，不同生產廠家的產品，甚至同一產家不同批號的產品都會存在差異[2]。依據ISO/IEC17025：2005《檢測和校準實驗室能力的通用要求》，對培養基的供應企業進行評價后選擇合格的供應商，這是培養基購買過程中重要的步驟。應選擇產品市場信譽度高、有質量保證和服務保證能力的企業；企業是否通過了質量管理體系是較為客觀的評價指標。但要求生產企業提供：培養成分名稱及產品編號、批號、使用前的PH值、儲藏信息和有效期、性能評價和所用測試菌株、技術數據清單、質控證書和必要的安全/危害數據等材料[3]。

3培養基的貯存

干粉培養基應保存在陰涼干燥處，避免陽光直射；末開瓶的培養基在室溫下保存3年，開瓶后的干粉培養基易吸潮，應注意防潮并在6個月內用完。定期對儲存中的培養基進行常規檢查，如容器密閉性復查、首次開封日期、內容物的感觀檢查，如果培養基發生結塊、顏色異常和其他變質跡象就不能在使用，液體培養基和平板類的培養基儲存于2℃～8℃的冰箱內。

4培養基的制備

目前實驗室內培養基的配置主要分為干粉培養基和新鮮培養基二類。干粉培養基是將培養基原材料濃縮，噴霧干燥，然后根據要求將干粉原料按一定配比制成各種不同的培養基。干粉培養基在使用時，只需按說明書稱重，加入蒸餾水、分裝、高壓滅菌后即可使用[4]。

實驗室自做的培養基必須準確根據處方，做好培養基的配置記錄，對配方中各成分應該分別添加，注意添加順序，分裝滅菌之前各成分應互溶或完全均勻。

4.1培養基制備用水 應使用電阻率不小于30萬Ω的蒸餾水或與其同質的水，不使用去離子水和自來水，因為去離子水即使經過濾除菌還是可能含有抑制一些微生物生長的物質，自來水中含有有效氯等抗菌物質，培養基加水時應沿著容器壁緩慢加入，可先加入1/3水量，振搖后再加入剩余的2/3水量，并順勢將附著于容器壁的培養基粉末沖下。其次實驗室內的蒸餾水不可保存時間過長，最好3個月內進行更換，以保證蒸餾水內無微生物的污染。

4.2培養基的稱量和用量的計算

4.2.1培養基的稱量 稱量時要用專用的角匙，若稱量多種培養基，每次使用后角匙要清洗，晾干后再進行稱量，避免交叉污染而影響檢測結果。稱量粉末類培養時盡量戴上口罩，防止粉末的吸入，做好檢驗人員的個人防護工作。選擇性的培養基極易吸潮，吸潮后培養基的pH將降低，改變了培養基的性質，所以應選擇濕度較低的房間作為培養室或干粉類的培養基選擇專用房間稱量。

4.2.2培養基用量的計算 按照培養基的用法說明由配方的規定和需要制備的培養基數量精確計量取用，不同批號、不同廠家同一種的培養基用量和配置存在著不同，每一次使用，都要核對用法，重新計算用量。

4.3培養基的復水 復水所用的玻璃容器最好為中性硬質的材料，耐高溫高壓，不銹鋼器具為316L材質經焊縫射線檢測，不使用銅鍋和鐵鍋，防止金屬離子的析出。計量的器具每年要進行校正，合格后才可使用。新使用的玻璃容器要使用0.2%的過氧乙酸浸泡24h，沖洗干凈后才可使用，這樣可防止容器中存有的游離堿性物質，使培養基中的pH值升高[5]。容器大小的選擇：應根據配置的需要大于復水后培養基總體積的二倍以上，防止在加熱溶解時培養基溢出。

5培養基的分裝

根據需要將培養基分裝于不同的三角燒瓶、試管等

5.1基礎培養基 實驗室應常貯有無菌的基礎培養基，以便臨時分裝或配制鑒別培養基等。分裝的量根據使用目的和要求決定，但必須定量分裝，便于應用。一般分裝于三角燒瓶或鹽水瓶內，高壓滅菌后備用。

5.2瓊脂斜面 分裝量為試管容量的1/5，滅菌后需趁熱放置成斜面，斜面長度約為試管長度的2/3。

5.3半固體培養基 分裝量約為試管的1/3，高壓滅菌后直立凝固備用。

5.4高層瓊脂 分裝量約為試管長度的1/3，高壓滅菌后趁熱直立，待冷后凝固備用。

6培養基的溶解和滅菌

稱量后的培養基各成分應根據規定加熱煮沸使其完全溶解，最好以流通蒸氣熔化30min，應使用電磁爐等加熱，避免使用電爐明火設備，應小火加熱，邊加熱邊攪拌，溶化完畢，應注意補足失去的水分，如有培養基的溢出或焦化，則該培養基不能再使用，需要重新配置。

7培養基的pH值

微生物必須在適宜的pH范圍內才能正常生長繁殖或體現其生物特征。培養基配方要求的pH值為滅菌或消毒后的pH值，即培養基使用前的pH，應在25℃溫度下采用精密酸度計進行測量，固體培養基應以特殊的膠體表面測量電極進行測量。一般培養基需矯正pH至7.4～7.6，此外亦有需要酸性或堿性的培養基。培養基在高壓滅菌后會有所變化，一般來說，用NaOH調節時，滅菌后會下降0.1～0.2；用DaHCO3調節時，滅菌后會上升0.1左右[6]。故矯正應掌握這種變化規律。

8培養基的保溫

滅菌后的培養基應迅速冷卻至所需的溫度，避免長時間保存在滅菌鍋內，造成過度滅菌，影響培養基的營養成分或選擇效果。采用水浴鍋保溫，水溫一般調至45℃～55℃，水位液面應略高于培養基液面，傾注平板時取出培養基自然降溫至45℃～55℃左右。建議以較低的溫度進行平板傾注，可減少對樣品中微生物的熱損失，并可減少平板表面的冷凝水，利于觀察結果[7]。

8.1培養基的接種 平板在接種使用時，表面必須無明顯潮濕水珠，潮濕的平板容易造成菌落擴散，不易進行菌落的計數，或進行平板分離時，造成菌落不純。若傾注培養基溫度過高造成的平板潮濕。可將平板放置在25℃～50℃溫箱內烘烤，至培養基表面的水滴完全消失，但溫度不可過高、時間不可過常。

8.2接種物的培養 溫箱內培養的培養基不要堆積過高，平板類一般高度為6個，液體類不能超過溫箱容積的2/3量，要留有一定的空間，使箱內的空氣可流通，培養基可盡快而均勻地接近設定的溫度。在厭氧罐里平板的堆積應超過6個高度[8]。在培養箱內，瓊脂平板有可能喪失一定的濕度，當喪失15%的水含量時，對微生物的生長不利。

9培養基的質量控制

對于新購的不同批次的商品化培養基在使用前進行瓶培養基的性能測試，符合要求后才可使用。制備好的成品培養的質量控制主要包括物理指標和微生物指標的測試，根據測試的結果及時填寫\"實驗室制備培養基測試結果記錄單\"。

9.1物理指標的控制

9.1.1測試20℃～25℃的pH值。

9.1.2檢查瓊脂的厚度、色澤、透明度和（或）是否存在肉眼可見雜質；凝膠穩定性、粘稠度和濕度。

9.2微生物學指標控制 可根據要求選用定量方法、半定量方法或定性方法對培養基性能進行測試。

9.2.1微生物污染的控制 從每批制備好的培養基中選取至少（或1%）平板或試管，置于37℃或按特定標準規定的溫度培養18h，然后記錄是否有菌落的生長。

9.3選擇性 將濃度為104cfu/mL-106cfu/mL的目標菌工作菌株懸浮液接種至選擇培養基和參考培養基中，培養基的選擇性應達到規定值[10]。

9.3.1定量的方法

選擇因子SF

SF=DO-DS

DO：參考培養基上至少10個菌落的最高稀釋度

DS：能在測試培養基上顯示生長的最高稀釋度

要求：非目標菌在選擇性培養基上的SF至少為2；半定量和定量法中，非目標菌應部分或全部被抑制。

9.4生理和生化特性 規定培養基的基本特性，可使用一套適當的測試菌株對培養基上目標菌的生理和生化特性（菌落形態、大小、顏色、光滑度等）和非目標菌被抑制程度進行測試。

按照規定得到的所有測試菌株的性能均符合規定，則該批培養基品質優良可在檢測中使用；若只有物理指標和微生物指標符合規定，則該批培養可被接受，尚可在檢測中使用。

10討論

培養基的質量在檢測工作中至關重要，如果在工作中忽視任何一個環節的質量問題，將導致偏離檢測結果的科學性、客觀性，影響檢測結果的準確性，因此加強實驗室內培養基的質量控制，建立起符合本單位的培養基作業指導書已迫在眉睫。我們只有認真做好培養基的質量管理工作，不斷完善和提高培養基的質控水平，才能為微生物檢測工作提供合格的高質量培養基。

參考文獻：

[1]NCCLS. NCCLS. documenM22-A2（ISBN56238-316-7），2000，16（16）.

[2]Otto V. American Joumal of Medical Technology，1999，43（4）：345-348.

[3]Appendix A. Intermational Joumal of Food Miciobiology，2000，2：133-136.

[4]唐細良，史娟.影響衛生微生物檢驗質量的兩個因素研究[J].實用預防醫學，2009，7（4）：314-315.

[5]劉春梅，蔡芷荷，吳清平.食品衛生微生物檢驗中培養基的質量控制[J].中國衛生檢驗雜志，2009，17（4）：700-701.

[6]呂蠅凱.NCCLS關于商品微生物培養基的保證[J].上海醫學檢驗雜志，2010，13（2）：117-118.

[7]饒紅，陳廣全.微生物實驗室的質量保證措施[J].檢驗檢疫科學，2009，6（4）：31-33.

[8]馮仁豐.臨床實驗室建設與管理[M].上海：上海科學技術出版社，1990.

[9]陳天壽.微生物培養基的制造與應用[M].北京：中國農業出版社，1995：8-143.

編輯/申磊