miRNA—126、TSLP在哮喘患者中的表達及影響

支氣管哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，研究已經證實Th1/ Th2 細胞亞群的失衡是哮喘發病的核心環節[1]，Th2 優勢分化免疫應答釋放Th2型細胞因子增多導致嗜酸粒細胞性氣道炎癥是哮喘特征性病理改變之一成為共識[2]，胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）近來被認為能調節Th2型細胞因子如IL-4的合成及表達從而在Th1/Th2平衡中對Th2 優勢分化免疫應答起到調控作用， 是免疫調控通路中的一個重要節點分子[3]，我們在前期對哮喘模型小鼠TSLPmRNA及Th2型細胞因子IL-4、IL-5、IL-13的研究中觀察到哮喘模型組TSLPmRNA相對表達量及IL-4水平均顯著升高， IL-5、IL-13水平也升高，也提示TSLP可能是哮喘發生機制中重要的調控分子。但對于TSLP上游的調控分子的研究甚少，特別是基因層面的，鑒于微型RNA（Micro RNA，miRNA）參與細胞增殖、分化等功能的調節，近來在哮喘發病機制及作用受到關注[4，5]。

1 資料與方法

1.1一般資料 2012年7月～2013年3月在本院呼吸科門診及呼吸內科病房診治的符合納入標準的哮喘患者12例，作為哮喘組，男7例，女5例，平均年齡（32.54±12.18）歲，平均病程（5.78±2.65）年；急性發作期6例，慢性緩解期6例。另外選取自愿接受檢查、近4w內無呼吸道感染、無吸煙史，胸部X線、肺功能正常健康人12例，作為對照組，男8例，女4例，平均年齡（36.22±10.23）歲；兩組患者性別、年齡，差異無統計學意義（P>0.05）。本研究得到研究對象的知情同意。

1.2納入標準 符合中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組的支氣管哮喘防治指南的診斷標準無吸煙史或至少戒煙 2年以上，近4w內無呼吸道感染史和激素等哮喘藥物使用史。

1.3排除標準 支氣管哮喘重度患者和哮喘持續狀態者；合并變應性鼻炎者；合并有心血管、 肝、腎、內分泌或造血系統等嚴重原發病及精神病患者；妊娠期或哺乳期婦女；口服激素患者；茶堿類制劑過敏患者。

1.4方法

1.4.1血液標本采集與處理 抽取各受試者空腹外周靜脈血 10ml，加入EDTA1mL抗凝，淋巴細胞分層液密度梯度離心（4℃，2000r·min-1，5min）。 分離出血漿及外周血單個核細胞，-70℃保存待測。

1.4.2肺泡灌洗液采集與處理 經纖維支氣管鏡收取支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）， 纖支鏡頂端楔入右肺中葉開口處， 從活檢口分3次注入37℃無菌生理鹽水，50ml/次， 負壓吸引回收灌洗液， 回收約20ml/次， 3次共約回收60ml，回收液經雙層紗布過濾，離心（4℃，1500r·min-1，10min），用細胞沉降管將離心沉淀細胞直接均勻地平鋪于載玻片上，自然風干，常規HE染色，在鏡下進行分離計數。

1.4.3miRNA-126表達檢測 采用RT-PCR 法檢測外周血淋巴細胞miRNA-126 的表達，Trizol一步法提取總 RNA，氯仿和異丙醇抽提。紫外分光光度儀和瓊脂糖電泳鑒定 RNA的濃度和純度，取10μl根據逆轉錄試劑盒說明逆轉錄合成 cDNA，-70℃ 凍存備用。取5μl逆轉錄產物進行 PCR擴增反應，以通用引物為內對照。

1.4.4TSLP、IL-4、IL-5和IL-13的檢測 ELISA法檢測BALF中的TSLP和血漿IL-4、IL-5和IL-13的水平，按照試劑盒說明書進行操作。

1.5統計學處理 采用 SPSS12.0 軟件進行數據分析，計量資料用（x±s）表示， 兩組間比較采用獨立樣本 t檢驗， P<0.05為有統計學意義。

2 結果

BALF細胞總數和分類計數 和對照組比較，哮喘組中性粒細胞比率升高，差異有統計學意義（P<0.05）；哮喘組嗜酸性粒細胞比率顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）。見表1。

3 討論

本研究顯示，miRNA-126在哮喘組高表達，和對照組比較，表達倍數顯著升高（P<0.01），我們前期的動物實驗結果表明，哮喘模型小鼠miRNA-126表達水平顯著升高，IL-4和IgE水平也均顯著升高，提示miRNA-126在哮喘患者和哮喘模型小鼠中均高度表達，miRNA-126能調節IL-4和IgE水平。上述研究表明，miRNA-126和TSLP都能調節Th2型細胞因子水平從而調控Th2細胞的優勢分化免疫應答，同時，生物信息學方法也提示TSLP可能是miRNA-126的作用靶基因[6]，因此，推測miRNA-126可能通過調節TSLP從而調控Th2細胞的優勢分化、Th2型細胞因子水平參與哮喘的調控機制的，需要進一步的實驗研究工作。

參考文獻：

[1]Ray A， Cohn L. Altering the Th1/ Th2 balance as a therapeutic strategy in asthmatic diseases [J] . Curr Opin Investig Drugs， 2000， 1（4）： 442-448

[2]Rautajoki KJ， Kylaniemi MK， Raghav SK， et al. An insight into molecular mechanisms of human T helper cell differentiation [J]. Ann Med， 2008，40（5）：322-335

[3]Mou Z， Xia J， Tan Y， et al. Overexpression of thymic stromal lymphopoietin in allergic rhinitis[J]. Acta Otolaryngol， 2009 ，129（3）：297-301

[4]Foster PS， Plank M， Collison A， et al . The emerging role of microRNAs in regulating immune and inflammatory responses in the lung[J]. Immunol Rev， 2013，253（1）：198-215

[5] Greene CM， Gaughan KP. microRNAs in asthma： potential therapeutic targets[J].

Curr Opin Pulm Med，2013，19（1）：66-72

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編輯/哈濤