紫海膽腸道真菌Aspergillussp.HDf2次生代謝產物抗生物污損活性的研究

摘要 [目的]對紫海膽腸道曲霉菌Aspergillus sp. HDf2的次生代謝產物進行抗海洋生物污損活性研究。[方法]采用搖瓶液體發酵，運用柱層析等方法， 從發酵液中分離、純化獲得4個γ丁烯酸內酯類單體化合物（-）-spiculisporic acid、spiculisporic acids B–D和1個secospiculisporic acid B，并且對其進行了抗藤壺幼蟲附著活性測試。[結果]化合物spiculisporic acid B和secospiculisporic acid B在濃度為25 mg/L時均具有抗藤壺幼蟲附著活性，其中化合物secospiculisporic acid B活性最強，其他化合物無活性。[結論]該研究首次報道它具有抗生物污損活性。

關鍵詞 曲霉菌；海洋真菌；次生代謝產物；抗污損；藤壺

中圖分類號 S917.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）25-08492-02

Abstract [Objective] Antifouling activity of the secondary metabolites from the sea urchin （Anthocidaris crassispina） associated fungus Aspergillus sp. HDf2 was investigated. [Method] Four γbutenolide derivatives， including （-）-spiculisporic acid， spiculisporic acids B–D， and one secospiculisporic acid B， were isolated from the filtrate of the fermented culture broth by chromatographic methods. Their antilarval settlement activity against barnacle Balanus amphitrite were tested.

[Result] Only two compounds， spiculisporic acid B and secospiculisporic acid B， were active against the larval settlement of Balanus amphitrite under 25 mg/L， in which secospiculisporic acid B showed the strongest activity. [Conclusion] The antifouling acitivity of these compounds were reported here for the first time.

Key words Aspergillus sp.； Marine fungus； Secondary metabolites； Antifouling； Balanus amphitrite

在人類開發利用海洋的歷史進程中，海洋生物污損一直是困擾海洋運輸、海洋工程和海洋漁業的重大難題之一，如加速污損生物附著基材的腐蝕、堵塞濱海發電廠和艦船的冷卻水管道、增加船體粗糙度、堵塞海水養殖網箱網眼導致水流不暢，進而影響養殖產量和質量[1]。天然產物已被證明是有前途的環保型抗污損劑[2-4]。海洋真菌能夠產生結構與活性多樣的天然產物，諸如抗菌、抗腫瘤、抗病毒的萜類和聚酮類化合物[5-8]。前人已從海綿、珊瑚和海藻中分離得到許多具有強抗污損活性的天然產物[2，9]，而目前對于海洋真菌抗海洋污損生物的次生代謝產物的研究相對較少。由于真菌代謝產物豐富，活性多樣，它可能產生具有抗污損活性的代謝產物。筆者前期從一株紫海膽腸道真菌Aspergillus sp. HDf2 的代謝產物中分離、鑒定了一系列具有抗菌活性的新型刺孢青霉素類化合物[8，10]，其結構與具有抗多種海洋生物污損活性的丁烯酸內酯類化合物如5octylfuran2（5H）one類似[11-12]。根據它們的結構特征，推斷該類新型刺孢青霉素類化合物可能也具有抗海洋生物污損活性。筆者從該菌中分離富集該類型化合物（圖1），對其抗藤壺幼蟲附著活性進行報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

儀器與試劑。減壓濃縮使用旋轉蒸發儀EYELA N1000；高分辨質譜由Agilent 6210 TOF LCMS質譜儀測定；化合物1H和13CNMR數據由Bruker DRX500核磁共振波譜儀測定，以TMS為內標；層析柱硅膠（200～300目）和薄層層析硅膠（GF254）均為青島海洋化工廠出品；Sephadex LH20和ODS反相硅膠分別購自瑞士GE Healthcare BioSciences和日本YMC公司；HPLC實驗中使用色譜試劑購自美國Tedia Company Inc.。其余試驗使用試劑均為分析純。

1.1.2

培養基。真菌培養與保存用培養基為麥芽培養基（MEA）平板，即麥芽20 g、蔗糖20 g、蛋白胨1 g、瓊脂條20 g、水1 000 ml。麥芽沸水煮30 min后，過濾，定容，分裝。發酵培養基為液體MEA。

1.1.3

菌株。真菌Aspergillus sp. HDf2是筆者先前從我國海南瓊海海岸采集的紫海膽腸道中分離、純化得到[8]。

1.2 方法

1.2.1

菌株的發酵。Aspergillus sp. HDf2經MEA平板活化，培養條件為28 ℃，暗培養7 d，之后取菌塊直接接種于液體MEA培養基中，每瓶液體培養基400 ml，共接種40瓶三角燒瓶（1 000 ml），于三層搖床上培養13 d（140 r/min，28 ℃）。

1.2.3

化合物抗藤壺幼蟲附著活性測試。 藤壺無節幼蟲在28 ℃下用硅藻Chaetoceros gracilis Schutt喂養，約4 d后發育至金星幼蟲階段。將金星幼蟲過濾并保存在0.22 μm濾膜過濾的海水中，同時將幼蟲放置在4 ℃冰箱中過夜待用。在活性測試中，化合物用DMSO配制成0、5、25 mg/L濃度。將24孔板中每個孔放置1 ml待測溶液，然后將15只藤壺幼蟲輕輕地轉移至每個含有待測溶液的孔中進行測試。將1 μl DMSO加到1 ml過濾海水中，同時每個孔放15只幼蟲作為陰性對照組。將測試板放置于28 ℃培養箱中，暗培養48 h。在培養結束后，將24孔板放置在顯微鏡下觀察，記錄游動、附著和死亡的幼蟲。附著的幼蟲個數與總幼蟲個數的比值就是附著率。每個樣品在每個濃度下測試，3次重復。

2 結果與分析

從紫海膽腸道真菌Aspergillus sp. HDf2的發酵產物中分離純化得到5個單體化合物，即（-）-spiculisporic acid，spiculisporic acid B，spiculisporic acid C，spiculisporic acid D和secospiculisporic acid B。在抗藤壺幼蟲附著活性測試中，發現它們在濃度為25 mg/L時，藤壺幼蟲的附著率分別為0.903 089、0.826 389、0.959 091、0.903 030和0.798 718，p值（指與對照的顯著性差異值）分別為0.692 668、0.044 253、0.244 331、0.713 679和0.024 303，其中spiculisporic acid B和secospiculisporic acid B的p值分別為0.044 253和0.024 303，均小于0.05，與對照存在0.05水平顯著性差異，二者均具有抗藤壺幼蟲附著活性，其中secospiculisporic acid B活性最強，而（-）-spiculisporic acid，spiculisporic acid C和spiculisporic acid D無活性。secospiculisporic acid B的化學結構與其他化合物的結構主要區別在于其為內酯開環化合物，可能該開環結構有助于其抗藤壺幼蟲附著活性。這與前期抗金黃色葡萄球菌活性結果不同。在20 mg/ml濃度下，它們均具有弱抗菌活性，表明內酯開環與閉環不影響其抗菌活性，但影響其抗菌活性強度。前人研究結果顯示，該類化合物的活性與內酯環存在相關關系，即活性成分主要是內酯開環類化合物[13-14]。這與該研究結果存在差異。前期根據其結構推斷該類化合物具有抗海洋生物污損活性，而研究結果只顯示紫

海膽腸道真菌Aspergillus sp. HDf2的發酵產物spiculisporic acid B和secospiculisporic acid B具有抗污損活性，其他化合物無活性。這可能是由于丁烯酸內酯類化合物如5octylfuran2（5H）one[11-12]內酯環中的α，β不飽和雙鍵對抗海洋生物污損活性具有重要貢獻。海洋污損生物還有苔蘚蟲、海藻等。下一步工作將擴大活性化合物抗污損生物范圍，期望能獲得抗海洋生物污損活性侯選化合物，應用于海洋運輸、海洋工程及海洋漁業，減少海洋污損生物對人類經濟活動產生的嚴重影響。

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