紫海膽腸道真菌Aspergillussp.HDf2次生代謝產(chǎn)物抗生物污損活性的研究

摘要 [目的]對(duì)紫海膽腸道曲霉菌Aspergillus sp. HDf2的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行抗海洋生物污損活性研究。[方法]采用搖瓶液體發(fā)酵，運(yùn)用柱層析等方法， 從發(fā)酵液中分離、純化獲得4個(gè)γ丁烯酸內(nèi)酯類單體化合物（-）-spiculisporic acid、spiculisporic acids B–D和1個(gè)secospiculisporic acid B，并且對(duì)其進(jìn)行了抗藤壺幼蟲附著活性測(cè)試。[結(jié)果]化合物spiculisporic acid B和secospiculisporic acid B在濃度為25 mg/L時(shí)均具有抗藤壺幼蟲附著活性，其中化合物secospiculisporic acid B活性最強(qiáng)，其他化合物無(wú)活性。[結(jié)論]該研究首次報(bào)道它具有抗生物污損活性。

關(guān)鍵詞 曲霉菌；海洋真菌；次生代謝產(chǎn)物；抗污損；藤壺

中圖分類號(hào) S917.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）25-08492-02

Abstract [Objective] Antifouling activity of the secondary metabolites from the sea urchin （Anthocidaris crassispina） associated fungus Aspergillus sp. HDf2 was investigated. [Method] Four γbutenolide derivatives， including （-）-spiculisporic acid， spiculisporic acids B–D， and one secospiculisporic acid B， were isolated from the filtrate of the fermented culture broth by chromatographic methods. Their antilarval settlement activity against barnacle Balanus amphitrite were tested.

[Result] Only two compounds， spiculisporic acid B and secospiculisporic acid B， were active against the larval settlement of Balanus amphitrite under 25 mg/L， in which secospiculisporic acid B showed the strongest activity. [Conclusion] The antifouling acitivity of these compounds were reported here for the first time.

Key words Aspergillus sp.； Marine fungus； Secondary metabolites； Antifouling； Balanus amphitrite

在人類開發(fā)利用海洋的歷史進(jìn)程中，海洋生物污損一直是困擾海洋運(yùn)輸、海洋工程和海洋漁業(yè)的重大難題之一，如加速污損生物附著基材的腐蝕、堵塞濱海發(fā)電廠和艦船的冷卻水管道、增加船體粗糙度、堵塞海水養(yǎng)殖網(wǎng)箱網(wǎng)眼導(dǎo)致水流不暢，進(jìn)而影響?zhàn)B殖產(chǎn)量和質(zhì)量[1]。天然產(chǎn)物已被證明是有前途的環(huán)保型抗污損劑[2-4]。海洋真菌能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)與活性多樣的天然產(chǎn)物，諸如抗菌、抗腫瘤、抗病毒的萜類和聚酮類化合物[5-8]。前人已從海綿、珊瑚和海藻中分離得到許多具有強(qiáng)抗污損活性的天然產(chǎn)物[2，9]，而目前對(duì)于海洋真菌抗海洋污損生物的次生代謝產(chǎn)物的研究相對(duì)較少。由于真菌代謝產(chǎn)物豐富，活性多樣，它可能產(chǎn)生具有抗污損活性的代謝產(chǎn)物。筆者前期從一株紫海膽腸道真菌Aspergillus sp. HDf2 的代謝產(chǎn)物中分離、鑒定了一系列具有抗菌活性的新型刺孢青霉素類化合物[8，10]，其結(jié)構(gòu)與具有抗多種海洋生物污損活性的丁烯酸內(nèi)酯類化合物如5octylfuran2（5H）one類似[11-12]。根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)特征，推斷該類新型刺孢青霉素類化合物可能也具有抗海洋生物污損活性。筆者從該菌中分離富集該類型化合物（圖1），對(duì)其抗藤壺幼蟲附著活性進(jìn)行報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

儀器與試劑。減壓濃縮使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀EYELA N1000；高分辨質(zhì)譜由Agilent 6210 TOF LCMS質(zhì)譜儀測(cè)定；化合物1H和13CNMR數(shù)據(jù)由Bruker DRX500核磁共振波譜儀測(cè)定，以TMS為內(nèi)標(biāo)；層析柱硅膠（200～300目）和薄層層析硅膠（GF254）均為青島海洋化工廠出品；Sephadex LH20和ODS反相硅膠分別購(gòu)自瑞士GE Healthcare BioSciences和日本YMC公司；HPLC實(shí)驗(yàn)中使用色譜試劑購(gòu)自美國(guó)Tedia Company Inc.。其余試驗(yàn)使用試劑均為分析純。

1.1.2

培養(yǎng)基。真菌培養(yǎng)與保存用培養(yǎng)基為麥芽培養(yǎng)基（MEA）平板，即麥芽20 g、蔗糖20 g、蛋白胨1 g、瓊脂條20 g、水1 000 ml。麥芽沸水煮30 min后，過(guò)濾，定容，分裝。發(fā)酵培養(yǎng)基為液體MEA。

1.1.3

菌株。真菌Aspergillus sp. HDf2是筆者先前從我國(guó)海南瓊海海岸采集的紫海膽腸道中分離、純化得到[8]。

1.2 方法

1.2.1

菌株的發(fā)酵。Aspergillus sp. HDf2經(jīng)MEA平板活化，培養(yǎng)條件為28 ℃，暗培養(yǎng)7 d，之后取菌塊直接接種于液體MEA培養(yǎng)基中，每瓶液體培養(yǎng)基400 ml，共接種40瓶三角燒瓶（1 000 ml），于三層搖床上培養(yǎng)13 d（140 r/min，28 ℃）。

1.2.3

化合物抗藤壺幼蟲附著活性測(cè)試。 藤壺?zé)o節(jié)幼蟲在28 ℃下用硅藻Chaetoceros gracilis Schutt喂養(yǎng)，約4 d后發(fā)育至金星幼蟲階段。將金星幼蟲過(guò)濾并保存在0.22 μm濾膜過(guò)濾的海水中，同時(shí)將幼蟲放置在4 ℃冰箱中過(guò)夜待用。在活性測(cè)試中，化合物用DMSO配制成0、5、25 mg/L濃度。將24孔板中每個(gè)孔放置1 ml待測(cè)溶液，然后將15只藤壺幼蟲輕輕地轉(zhuǎn)移至每個(gè)含有待測(cè)溶液的孔中進(jìn)行測(cè)試。將1 μl DMSO加到1 ml過(guò)濾海水中，同時(shí)每個(gè)孔放15只幼蟲作為陰性對(duì)照組。將測(cè)試板放置于28 ℃培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)48 h。在培養(yǎng)結(jié)束后，將24孔板放置在顯微鏡下觀察，記錄游動(dòng)、附著和死亡的幼蟲。附著的幼蟲個(gè)數(shù)與總幼蟲個(gè)數(shù)的比值就是附著率。每個(gè)樣品在每個(gè)濃度下測(cè)試，3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

從紫海膽腸道真菌Aspergillus sp. HDf2的發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化得到5個(gè)單體化合物，即（-）-spiculisporic acid，spiculisporic acid B，spiculisporic acid C，spiculisporic acid D和secospiculisporic acid B。在抗藤壺幼蟲附著活性測(cè)試中，發(fā)現(xiàn)它們?cè)跐舛葹?5 mg/L時(shí)，藤壺幼蟲的附著率分別為0.903 089、0.826 389、0.959 091、0.903 030和0.798 718，p值（指與對(duì)照的顯著性差異值）分別為0.692 668、0.044 253、0.244 331、0.713 679和0.024 303，其中spiculisporic acid B和secospiculisporic acid B的p值分別為0.044 253和0.024 303，均小于0.05，與對(duì)照存在0.05水平顯著性差異，二者均具有抗藤壺幼蟲附著活性，其中secospiculisporic acid B活性最強(qiáng)，而（-）-spiculisporic acid，spiculisporic acid C和spiculisporic acid D無(wú)活性。secospiculisporic acid B的化學(xué)結(jié)構(gòu)與其他化合物的結(jié)構(gòu)主要區(qū)別在于其為內(nèi)酯開環(huán)化合物，可能該開環(huán)結(jié)構(gòu)有助于其抗藤壺幼蟲附著活性。這與前期抗金黃色葡萄球菌活性結(jié)果不同。在20 mg/ml濃度下，它們均具有弱抗菌活性，表明內(nèi)酯開環(huán)與閉環(huán)不影響其抗菌活性，但影響其抗菌活性強(qiáng)度。前人研究結(jié)果顯示，該類化合物的活性與內(nèi)酯環(huán)存在相關(guān)關(guān)系，即活性成分主要是內(nèi)酯開環(huán)類化合物[13-14]。這與該研究結(jié)果存在差異。前期根據(jù)其結(jié)構(gòu)推斷該類化合物具有抗海洋生物污損活性，而研究結(jié)果只顯示紫

海膽腸道真菌Aspergillus sp. HDf2的發(fā)酵產(chǎn)物spiculisporic acid B和secospiculisporic acid B具有抗污損活性，其他化合物無(wú)活性。這可能是由于丁烯酸內(nèi)酯類化合物如5octylfuran2（5H）one[11-12]內(nèi)酯環(huán)中的α，β不飽和雙鍵對(duì)抗海洋生物污損活性具有重要貢獻(xiàn)。海洋污損生物還有苔蘚蟲、海藻等。下一步工作將擴(kuò)大活性化合物抗污損生物范圍，期望能獲得抗海洋生物污損活性侯選化合物，應(yīng)用于海洋運(yùn)輸、海洋工程及海洋漁業(yè)，減少海洋污損生物對(duì)人類經(jīng)濟(jì)活動(dòng)產(chǎn)生的嚴(yán)重影響。

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