玉米單倍體加倍方法研究進展

摘要 主要綜述了近年來玉米單倍體加倍方法的最新研究進展。自然加倍法和以秋水仙素及除草劑為加倍劑的化學加倍法是人們研究較多的加倍方法。

關鍵詞 玉米單倍體；加倍方法；秋水仙素；除草劑

中圖分類號 S513 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）25-08542-02

Abstract The recent progress of doubling methods in maize haploid are reviewed. The main methods which included natural doubling and the chemical methods used colchicine， as well as other herbicides are more researched.

Key words Maize haploid； Doubling method； Colchicine； Herbicides

目前，利用孤雌生殖誘導系誘導是獲得玉米單倍體的重要方法，國內已有多家育種單位開始應用該技術。采用單倍體育種技術選育自交系可使材料的純化從常規育種的5～7年縮短到1～2年，大大提高了育種效率。國外許多公司已實現單倍體育種的規模化應用，但在國內單倍體育種還處于初步階段，尤其是誘導獲得的單倍體種子存在加倍率低等問題，限制了國內玉米單倍體育種的規模化開展。為了尋找單倍體高加倍率、操作方便、成本低的加倍方法，許多科研人員進行了深入的研究。目前研究較多的加倍方法主要有自然加倍法和和以秋水仙素及除草劑為加倍劑的化學加倍法。為便于這些方法更好地應用于玉米單倍體加倍，筆者對近年來有關玉米單倍體加倍的方法進行了綜述，以期為玉米單倍體育種工作者提供參考。

1 自然加倍法

關于單倍體的雌雄育性的自然恢復，劉志增等通過研究發現，平均有93.2%的單倍體雌穗是自然可育的， 雄穗的自然育性較低，散粉株率為5%～40%不等[1]，但由于單倍體存在雌雄嚴重失調，還有一定的空稈存在，導致單倍體的自然加倍結實率只有10%左右。不同的生態環境和基礎材料，單倍體自然加倍結實率的差異較大。氣候涼爽、晝夜溫差大的環境有利于單倍體植株的自然加倍；逆境生態條件（極端高溫、干旱、低溫寡照、瘠薄等）不利于單倍體的自然加倍[1]，因此自然加倍除了與材料特性有關之外，還與單倍體的種植季節、種植地點等生態環境有很大關系。

1.1 種植季節

關于單倍體自然加倍的最佳種植季節，研究結論不太一致，多數研究認為在北方春播和三亞冬播有利于單倍體自然加倍。如段民孝等研究發現，在北京地區播種的19個材料的單倍體結實率春播時期明顯高于夏播時期，16個材料的顯花藥率表現為春播時期高于夏播時期，春播和夏播玉米單倍體平均顯花藥率分別為26.9%和19.7%，平均結實株率分別為3.5%和2.1%，認為春播時期更有利于玉米單倍體的自然加倍[2]。劉志增等研究北京春播、北京晚春播、北京夏播、三亞播種對玉米單倍體加倍效果，結果表明，海南和北京夏播種植玉米單倍體的加倍率較差，并推論單倍體雄穗育性的自然恢復與生長前期環境溫度（或晝夜溫差）的變化具有負（或正）相關的趨勢[1]。許洛等分別在石家莊春播、石家莊夏播和三亞冬播3 種生態環境條件下開展了玉米單倍體自然加倍效果的研究，認為不同基因型材料間、不同環境條件下，玉米單倍體自然加倍效果差異明顯，其中三亞冬播效果最好，石家莊春播次之，石家莊夏播不適合單倍體自然加倍[3]。劉德友等通過在山東膠東半島的試驗認為夏播有利于單倍體自然散粉及自交結實。他們發現，夏播自然散粉率比春播高3.77%，自交結實率為6.23%～9.39%，單倍體自交結實率夏播比春播高2.37%[4]。蘆連勇等通過在河南安陽進行的試驗也認為夏播更有利于玉米單倍體的自然加倍。研究發現，不同材料來源的玉米單倍體夏播和春播的顯花散粉率平均分別為34.24%、29.37%，夏播比春播高4.87個百分點； 自交結實率夏播明顯高于春播[5]。不過，筆者通過在河南新鄉進行的單倍體自然加倍試驗，發現春播比夏播有利于單倍體的自然加倍。春播單倍體生長前期溫度低，溫差較大，應該更有利于單倍體的自然加倍。

1.2 種植地點

在不同的種植地點，春播和夏播對單倍體的加倍影響不盡相同，這就表明不同地點種植玉米單倍體自然加倍的影響存在明顯差異。如段民孝等認為，相比北京春季播種，甘肅春季播種和海南冬季播種比其他地點種植更有利于玉米單倍體自然加倍[6]。蔡泉等認為，相同來源的單倍體在海南、黑龍江省的自然加倍率差異顯著，不同來源的玉米單倍體在海南的自然加倍率均高于黑龍江省[7]。

2 化學加倍方法

2.1 秋水仙素加倍法

秋水仙素是一種應用最廣泛的化學加倍試劑， 原理是通過阻止細胞有絲分裂中期紡錘絲微管的收縮而使復制了的染色體不能移向細胞的兩極而實現染色體的加倍。它對植物的刺激作用只發生在細胞分裂時期，因此通常用來處理的為萌動或剛發芽的種子、正在膨大的芽及根尖或幼苗、嫩枝的生長點。秋水仙素的適宜濃度和處理時間的長短隨著所處理的器官和處理時的溫度有很大關系[8]。

選用秋水仙素處理單倍體方法有浸根法、浸芽法和注射法等，不同方法采用的藥劑濃度不同。采用浸芽法處理，操作方法簡單易行，而且具有較高的加倍效率。而當用秋水仙素處理玉米芽時，通常采用的濃度為0.05%～0.06%。如岳堯海等認為，秋水仙素濃度、浸芽溫度和浸芽時間對玉米單倍體加倍有明顯的影響，且差異達極顯著水平；用0.05%秋水仙素和5%二甲基甲砜混合藥劑在15 ℃下浸泡9 h，單倍體的加倍效果最好，加倍率可達38.1%[9]。蔡泉等用浸芽法處理單倍體，發現濃度在0.06%時平均存活率達到了71.7%，平均加倍率為21.9%[10]。段民孝等使用0.06%秋水仙素溶液分別浸泡幼芽上部和幼芽全部，發現浸泡幼芽上部處理能夠明顯減輕藥害，縮短緩苗時間，提高單倍體植株的加倍效果，成活率、授粉率和結實株率均是浸泡幼芽全部處理的1.5 倍左右，而且浸泡幼芽上部處理的授粉率和結實率分別是對照的2.0和4.0倍以上[11]。

注射法則一般選擇在6葉期注射濃度0.5%的秋水仙素加倍效果最好。如魏俊杰等在單倍體玉米6葉期， 分別用濃度為0.1%、0.5%、1.0%秋水仙素+2.0%二甲基亞砜（DMSO）混合液2.0 μl注射處理單倍體幼苗莖尖生長點，認為在6 葉期用注射處理法對玉米單倍體的加倍非常有效，受藥害株數較少，受藥害株率低，且0.5%秋水仙素濃度處理效果最好[12]。岳堯海等用高誘1號誘導的單倍體植株為材料，在5～6葉期用兩種濃度的秋水仙素配以二甲基亞砜（DMSO）注射處理莖尖生長點，不同基因型材料間有顯著差異，且濃度0.5%秋水仙素的處理效果最好[13]。

2.2 除草劑加倍法

由于秋水仙素毒性很大，處理單倍體的濃度和時間掌握不當，易導致單倍體成活率低。近幾年來，人們逐漸轉向利用除草劑進行單倍體加倍的研究，以便可以用除草劑取代秋水仙素用于玉米單倍體加倍。如惠國強等以先玉335、中農大4號和8607×8609共3個基因型誘導的單倍體子粒為材料，比較了甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟樂靈3種除草劑加倍玉米單倍體的效率。通過滴心法處理單倍體植株3葉期和5葉期幼苗，發現20～160 pmol/L的3種除草劑對玉米單倍體加倍均有效果，加倍率在3.42%～26.32%；甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟樂靈的加倍率分別為4.29%～26.32%、3.85%～20.81%和3.42%～17.61%，其中80 pmol/L甲基胺草磷的加倍效果最佳[14]。張良君等以高誘l號誘導的不同基因型玉米單倍體為材料，在3～5葉期用不同濃度的甲基胺草磷溶液進行滴心處理，研究甲基胺草磷加倍單倍體的效果，結果表明，100 μmol/L甲基胺草磷溶液處理的單倍體加倍效率最高[15]。慈佳賓等用氟樂靈、拿草特兩種抗微管除草劑和秋水仙素在不同處理部位、不同處理時間和濃度條件下對玉米單倍體進行單倍體加倍效率研究，結果表明，3 種藥劑用浸種法處理玉米單倍體的加倍率以氟樂靈在濃度80 μmol/L處理20 h 最高（35.7%），用浸芽法處理的加倍率以拿草特在濃度60 μmol/L 處理24 h 最高（24.8%），用浸根法處理的加倍率以氟樂靈在濃度40 μmol/L處理15 h最高（16.8%）[16]。王賀等以Mo17×PHB1M誘導的單倍體子粒為試驗材料，利用戊炔草胺、甲基胺草磷和秋水仙素為加倍藥劑，浸芽處理單倍體種子，結果表明，3種藥劑對玉米單倍體加倍均有效果，其中，8 mg/L戊炔草胺、21 mg/L甲基胺草磷、0.7 mg/L秋水仙素浸芽8 h的玉米單倍體加倍率均為各組最高，并認為戊炔草胺和甲基胺草磷可以替代秋水仙素加倍玉米單倍體[17]。

3 小結

單倍體加倍是玉米單倍體育種的制約因素。自然加倍法加倍無毒、無害、無污染、操作簡單，缺點是加倍率較低，一般加倍率高的材料可達10%左右。基于科研人員關于種植季節和種植地點對單倍體加倍的影響研究，筆者認為單倍體自然加倍可以選擇甘肅春播、海南冬播或者北方地區春播等進行。對于有些自然條件下不容易加倍或者加倍率極低的單倍體材料，可以選擇化學加倍方法進行加倍。 利用除草劑等化學加倍方法進行單倍體加倍加倍率最高可達35.7%。除草劑相對于秋水仙素而言，毒性較低，對材料的毒害較小，因此，甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟樂靈等除草劑應該是玉米單倍體加倍較理想的選擇。選用化學方法加倍，浸芽法操作方便，更利于玉米單倍體加倍的規模化。

參考文獻

[1] 劉志增，宋同明.玉米單倍體雌雄育性的自然恢復以及染色體的化學加倍[J].作物學報，2000，26（6）：947-952.

[2] 段民孝，趙久然，劉新香，等.春夏不同播期對玉米單倍體自然加倍率的影響[J].玉米科學，2011，19（5）：39-42.

[3] 許洛，王紹新，馮健英，等.不同生態環境的玉米單倍體自然加倍效果研究[J].河北農業科學，2013，17（3）：63-65.

[4] 劉德友，趙延明.不同基因型不同播期玉米單倍體自然加倍效果的研究[J].中國農學通報，2010，26（19）：37-39.

[5] 蘆連勇，王海莉，董文恒，等.玉米單倍體在春夏不同播期條件下的自然加倍效果研究[J].安徽農業科學，2012，40（18）： 9613-9614，9625.

[6] 段民孝， 趙久然， 劉新香，等.不同種植地點對玉米單倍體自然加倍率的影響[J].作物雜志，2012（2）：68-70.

[7] 蔡泉，曹靖生，史桂榮，等.玉米單倍體在黑龍江與海南自然加倍效果的對比研究[J].玉米科學，2012，20（5）：7-9.

[8] 陳紹江，黎亮，李浩川.玉米單倍體育種技術[M].北京：中國農大出版社， 2009：52-53.

[9] 岳堯海，張志軍，路明，等.東北生態區玉米單倍體浸芽加倍效果的初探[J]. 作物雜志，2012（5）：114-117.

[10] 蔡泉，張建國，趙偉， 等.Stock6雜交誘導的玉米單倍體加倍效果研究[J].黑龍江農業科學，2011（11）：1-4 .

[11] 段民孝，劉新香，趙久然，等.秋水仙素浸芽法處理玉米單倍體的加倍效果研究[J].種子，2013（2）：19-23.

[12] 魏俊杰，張曉麗，陳梅香，等.六葉期秋水仙素注射處理玉米單倍體的加倍效果研究[J]. 玉米科學，2007， 15（4）： 49-51.

[13] 岳堯海，王敏，張志軍，等.玉米單倍體加倍效果的研究[J].吉林農業科學，2011，36（5）：9-12.

[14] 惠國強，嚴建兵，杜何為，等.不同除草劑加倍玉米單倍體的效率[J].作物學報， 2012，38（3）：416-422.

[15] 張良君，趙延明，張海艷，等.甲基胺草磷加倍玉米單倍體效果的初步研究[J]. 山東農業科學，2013，45（10）：29-31.

[16] 慈佳賓，李繼竹，劉振庫，等.抗微管除草劑對玉米單倍體加倍效果研究[J].玉米科學，2012，20（5）：10-14.

[17] 王賀，李繼竹，張繼偉，等.秋水仙素和除草劑浸芽加倍玉米單倍體效率的研究[J].吉林農業大學學報，2013， 35（4）：384-388.