豬偽狂犬病毒湖北株gE基因的克隆與序列分析

摘要 [目的] 通過(guò)對(duì)從湖北省某豬場(chǎng)分離獲得的偽狂犬病毒的gE基因克隆和測(cè)序，分析其遺傳變化規(guī)律。[方法]參考GenBank中豬偽狂犬病病毒（Porcine pseudorabies Virus，PRV）gE基因的序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，對(duì)PRV湖北株gE基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析，PCR產(chǎn)物克隆到pMD 18T載體。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶分析和基因測(cè)序，與GenBank收錄的國(guó)內(nèi)外其他地區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)參考毒株進(jìn)行同源性分析和比較。[結(jié)果]與標(biāo)準(zhǔn)參考毒株的核苷酸序列同源性為95.0%～98.0%，進(jìn)化樹(shù)分析表明，PRVHBXS2014株與河南焦作株EU561349China同屬于一個(gè)分支，親緣關(guān)系較近，但存在個(gè)別位點(diǎn)的基因突變。[結(jié)論] 為有效防控該病提供參考。

關(guān)鍵詞 豬偽狂犬病毒；gE基因；PCR擴(kuò)增；克隆；序列分析

中圖分類(lèi)號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）25-08502-02

Abstract [Objective] Based on cloning and sequencing of Hubei strain gE gene of porcine pseudorabies virus isolated from a pig farms in Hubei Province， their genetic variation was analyzed. [Method]A pairs of primers were designed and the sequence of gE gene of pseudorabies virus in the reference GenBank，PCR amplification and sequence analysis of PRV Hubei strain gE gene was done，and the PCR product was cloned into pMD 18T vector.By restriction enzyme analysis and sequencing of recombinant plasmid， homology analysis and comparison with the other regions included in GenBank standard reference strains at home and abroad.[Result]The results showed that with the standard reference strains， the nucleotide sequence homology of 95.0%-98.0%， phylogenetic tree analysis showed that，PRVHBXS2014 strain and Jiaozuo EU561349China in Henan strain belonged to the same branch， close relationship，but there are some gene mutation，and the results were consistent with the reported in the literature.[Conclusion] The study provided a reference for effective prevention and control of the disease.

Key words Porcine pseudorabies virus；gE gene；PCR amplification；Cloning；Sequence analysis

偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是由偽狂犬病毒（PRV）引起的多種家畜和野生動(dòng)物均可感染的急性傳染病，以發(fā)熱、流產(chǎn)、死產(chǎn)、奇癢（豬除外）和腦脊髓炎為主要癥狀，其中對(duì)豬的危害最大，且豬是唯一的自然宿主[1]。

PRV屬于皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科，為雙鏈DNA，全長(zhǎng)約150 kb，基因組GC含量最高達(dá)73%，包括70多個(gè)開(kāi)放性閱讀框，可以編碼70～100種病毒蛋白。gE基因?qū)RV體內(nèi)毒力表達(dá)、侵襲神經(jīng)和沿著神經(jīng)傳遞起著決定性的作用。目前gE缺失疫苗在病毒侵入神經(jīng)系統(tǒng)方面被認(rèn)為比其他單個(gè)非必需糖蛋白缺失苗更安全，同時(shí)gE不會(huì)影響病毒的復(fù)制和中和抗體的產(chǎn)生，且gE是所有野毒株均表達(dá)的一類(lèi)糖蛋白。因此gE可作為PR凈化過(guò)程中標(biāo)志基因，可區(qū)別感染動(dòng)物和接種動(dòng)物，以剔除陽(yáng)性的野毒感染動(dòng)物[2-3]。

2012年以來(lái)，我國(guó)許多省市暴發(fā)臨床癥狀疑似偽狂犬病的傳染病，尤其一些免疫過(guò)gE缺失疫苗的豬場(chǎng)也暴發(fā)該病，主要表現(xiàn)為豬群gE抗體陽(yáng)性率顯著升高，母豬產(chǎn)弱仔、死胎，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及死亡等，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。筆者通過(guò)對(duì)從湖北省某豬場(chǎng)分離獲得的偽狂犬病毒的gE基因繼續(xù)克隆和測(cè)序，分析其遺傳變化規(guī)律，為有效防控該病提供參考。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞 偽狂犬湖北株P(guān)RVHBXS2014株（武漢大學(xué)菌種庫(kù)保藏號(hào)：CCTCC V201420），BHK21細(xì)胞與大腸桿菌DH5α均為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院動(dòng)物胚胎工程分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.2 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)基MEM和無(wú)菌小牛血清購(gòu)自GIBCO公司；2×EasyTaq PCRMix購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ、pMD 18T載體及其連接試劑、DL2000 Marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒和DNA小提試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司。

1.3 病毒培養(yǎng) 將偽狂犬毒株用BHK21細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)液，維持液為含2%小牛血清的MEN培養(yǎng)液。待細(xì)胞長(zhǎng)至90%以上時(shí)加入適量病毒液，37 ℃吸附1 h，加入適量維持液，37 ℃培養(yǎng)，在細(xì)胞病變達(dá)到80%以上時(shí)停止培養(yǎng)，反復(fù)凍融3次后收獲病毒培養(yǎng)液。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank中已報(bào)道的豬偽狂犬病毒gE基因序列設(shè)計(jì)，上游引物P1：5’GCGGCCCTTTCTGCTGCG3’；下游引物P2：5’AGCGGGGCAGGACATCAA3’。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 DNA的提取 采用愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司DNA小提試劑盒提取并于-20 ℃保存。

1.6 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系體積為50 μl，其中10 μmol/L上下引物各1 μl，DNA 模板5 μl，2×EasyTaq PCRMix 25 μl，剩下添加ddH2O至50 μl。反應(yīng)程序：97 ℃ 10 min，72 ℃ 4 min；95 ℃ 1 min，65 ℃退火 2 min，72 ℃ 2.5 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.7 PCR產(chǎn)物克隆和測(cè)序 PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定連接反應(yīng)體系為10 μl，依次加入PCR產(chǎn)物5 μl、pMD18T載體1 μl、連接緩沖液4 μl，16 ℃連接4 h。取5 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至制備好的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于含氨芐青霉素的LB平板，37 ℃培養(yǎng) 12～16 h。從平板上挑取單菌落接種于3 ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，37 ℃振蕩培養(yǎng)16～20 h。提取質(zhì)粒，用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切質(zhì)粒后電泳，按分子量大小初步篩選陽(yáng)性菌株，鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒。將酶切鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送到上海生工生物工程有限公司測(cè)序，然后利用基因分析軟件DNAStar對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 gE基因的PCR擴(kuò)增 以偽狂犬病毒湖北株DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到1 626 bp的片段，與預(yù)期相符（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

提取重組質(zhì)粒后選用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，獲得2條大小為2 692和1 626 bp左右的片段，分別與預(yù)期基因片段大小相符（圖2）。

2.3 gE基因的序列測(cè)定及其分析 利用DNAStar軟件將測(cè)出的HBXS2014gE基因全序列（圖3）與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的PRV分離株（AY183124、湖北Ea株AF171937、廣東SH株EF552427、AF207700、美國(guó)Becker株AY368490、FJ605135、JF460026、JX417716、Fa株AF403049、河南焦作株EU561349China、Malaysia株FJ176390、GZZ1株HQ832846、西班牙NiA3株EU502923、Rice株M14336、MINA株AY170318）進(jìn)行核苷酸同源性比較分析。

3 討論

近年來(lái)，豬偽狂犬病席卷全國(guó)大部分省份，臨床病例呈逐漸上升趨勢(shì)。目前表現(xiàn)為臨床癥狀不明顯，仔豬少見(jiàn)神經(jīng)癥狀，母豬主要表現(xiàn)為流產(chǎn)和死胎，發(fā)病出現(xiàn)急性死亡，犬貓大量死亡；免疫不同廠家不同毒株疫苗依然發(fā)病；臨床抗體檢測(cè)免疫效果好的豬場(chǎng)依然發(fā)病；豬偽狂犬病毒野毒的感染率在70%～80%。目前已給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

該研究通過(guò)PCR技術(shù)成功克隆出了PRVHBXS2014株的gE基因，序列全長(zhǎng)為1 626 bp，通過(guò)與國(guó)內(nèi)外已公布序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，該毒株與EU561349China株同源性最高，同屬于一個(gè)分支，通過(guò)核苷酸序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)存在一定的基因突變現(xiàn)象。

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