水稻紋枯病拮抗細菌的篩選·鑒定及其活性成分的發酵制備

摘要 [目的]探究水稻紋枯病拮抗細菌的抑菌活性成分的發酵制備條件。[方法]通過點接種于平板與水稻紋枯病對峙生長對水稻紋枯病拮抗細菌進行了初篩，通過搖瓶發酵進行了復篩，并通過形態鑒定及16S RNA測序構建系統發育樹對所得菌株進行鑒定；通過單因素試驗研究了所得菌株的抑菌活性成分的發酵制備條件。[結果]初篩獲得17株水稻紋枯病的拮抗細菌，復篩獲得菌株Lys67，該菌株的發酵液對水稻紋枯病生長具有明顯的抑制作用，菌株Lys67鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。經單因素試驗，菌株Lys67利用麩皮5.0%，于35 ℃、搖床轉速200 r/min條件下發酵3 d，經牛津杯打孔法檢測，150 μl發酵液中活性成分抑制水稻紋枯病的抑菌圈達36 mm。[結論]為菌株Lys67的進一步研究及生防應用奠定了基礎。

關鍵詞 水稻紋枯病；拮抗菌；篩選；發酵；生物防治

中圖分類號 Q93.3；S435.111.4+2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）25-08584-03

Abstract [Objective] The aim was to study the fermentation conditions of antagonistic bacteria active ingredient against Rhizoctonia solani. [Method] Some antagonistic bacteria against R. solani were screened through point inoculating contrary to R. solani on agar petri plates and shaking flask fermentation； the obtained strain was identified through morphological identification and 16S RNA sequencing to construct phylogenetic tree； and fermentation conditions of active ingredient of the obtained strain against R. solani were studied through single factor experiment. [Result] Seventeen strains of bacteria antagonist R. solani were obtained， and strain Lys67 was obtained finally； strain Lys67 was identified as Bacillus subtilis. Also， 150 μl fermentation broth of strain Lys67 resulted in 36 mm of inhibition zone against R. solani， determining by method of drilling hole with Oxford cup on agar plate， while strain Lys67 was cultured in wheat bran 5.0%， at 35 ℃， rotation speed 200 r/min for three days. [Conclusion] The results lay basis for further study and application of strain Lys67.

Key words Rhizoctonia solani； Antagonistic bacteria； Screening； Fermentation； Biological control

水稻紋枯病是我國水稻種植區重要病害，嚴重時會導致我國水稻產量年損失在10%以上[1] 。目前，在生產上主要用3%井岡霉素水劑來防治水稻紋枯病，賴開平等[2]研究表明稀釋1 500倍的50%丙環唑左旋松油醇乳油的防效為82.02%。雖然化學農藥和抗生素效果較好，但長期使用會導致紋枯病菌產生抗藥性和農殘問題，且污染環境。自然界經過長期進化，存在大量拮抗病原微生物，尋求生物防治途徑已成為研究控制植物土傳病害的新方向。例如，孟德超等[3]獲得4株對水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）有強拮抗作用的菌株；宋雯雯等[4]報道了2株對稻瘟病菌有較強拮抗活性的菌株。筆者采用隨機法從水稻田篩選到與水稻紋枯病菌有強拮抗作用的菌株Lys67，并對該菌的進行了鑒定，旨在為該菌的進一步研究和生防應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

培養皿。平板及斜面培養基（WBA）：麩皮20.0 g，自來水180 ml，100 ℃微火煮沸20 min，并不斷添水，2層紗布擠壓過濾，濾液定容值200 ml，加4.0 g 瓊脂，自然pH，121 ℃滅菌20 min。液體發酵培養基：麩皮5.0 g，自來水95 ml，置于250 ml三角瓶中，自然pH，通氣棉塞封口，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2

供試病原真菌。

水稻紋枯病菌由湖南農業大學生物科學技術學院保存。將該菌株接種于WBA中28 ℃培養，待菌絲長滿平板呈白色，4 ℃冰箱保存備用。

1.2 方法

1.2.1

水稻紋枯病拮抗細菌的收集。從湖南農業大學耘園試驗田、瀏陽河畔等土壤隨機取土樣若干，按十倍稀釋法涂布平板，37 ℃培養1～2 d，待菌落長出后隨機挑取單菌落500余株，接種斜面，編號，37 ℃培養2 d備用。

1.2.2

水稻紋枯病拮抗細菌的初篩。將水稻紋枯病菌用無菌鑷子取一小塊點接種于WBA中央，28 ℃預培養1～2 d，當菌落直徑為0.8～1.0 cm時，再將所篩選到的500余株細菌分別接種于水稻紋枯病菌落四周，細菌接種點距水稻紋枯病菌落約10 mm，每個平板接種6～8株細菌，30 ℃培養，每12 h觀察細菌與水稻紋枯病對峙生長情況，記錄細菌拮抗效果。

1.2.3

拮抗細菌的搖瓶發酵復篩。選擇初篩拮抗效果較好的菌株，接種于100 ml發酵培養基，搖床轉速200 r/min下37 ℃培養3 d，取1.5 ml發酵液于EP管中，10 000 r/min離心5 min，上清用于活性成分的檢測。另配制WBA 200 ml，趁熱倒入放置7個牛津杯（呈星形排列）的平板中（10 ml/皿），凝固后，用無菌鑷子拔出牛津杯及杯中多余的培養基，形成小孔，在平板表面均勻接種水稻紋枯病菌，在中心孔中加入未接種的無菌培養基離心液150 μl為對照，四周孔中加入不同的發酵液上清150 μl，每個平板均勻撒入約50 mg硫酸鏈霉素，抑制細菌生長，記錄抑菌圈大小。

1.2.4

菌株Lys67拮抗水稻紋枯病的活性成分的發酵制備。以麩皮5.0%為基礎培養基，以溫度、培養基起始pH、發酵時間、麩皮含量為單因素變量，分別考察各變量對菌株Lys67的活性成分的影響，活性成分抑制水稻紋枯病的檢測按“1.2.3”方法進行。

1.2.4.1

溫度對菌株Lys67產抑菌活性物質的影響。配制液體發酵培養基，接種菌株Lys67后，分別置入30、33、35、37、40 ℃和200 r/min 條件下培養3 d，其發酵液進行抑制水稻紋枯病效果測定。

1.2.4.2

培養基起始pH對菌株Lys67產抑菌活性物質的影響。分別配制起始pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的液體發酵培養基，接種菌株Lys67后，于35 ℃、200 r/min 條件下培養3 d，其發酵液用于抑制水稻紋枯病效果測定。

1.2.4.3

發酵時間對菌株Lys67產抑菌活性物質的影響。配制液體發酵培養基若干，接種菌株Lys67后，于35 ℃、200 r/min 條件下培養，測定Lys67發酵不同時間后抑制水稻紋枯病的效果。

1.2.5

菌株Lys65的鑒定。

1.2.5.1

形態鑒定。菌株的細胞染色、形態特征、培養特征和生理生化分析等主要參照文獻[5]。

1.2.5.2

16S RNA鑒定。菌種送北京三博遠志生物科技公司進行測序，測序結果通過Blast與GenBank中的序列進行比對，構建系統發育樹進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 細菌拮抗水稻紋枯病的初篩結果

通過隨機法獲得500余株細菌，分別接種于水稻紋枯病菌落四周，經對峙生長，發現有17株細菌對紋枯病具有拮抗作用。其中，菌株Lys52、Lys67、Lys138、Lys375拮抗效果明顯，水稻紋枯病菌絲不能向細菌菌落一側延伸，而菌落的對側紋枯病菌絲生長良好；菌株Lys179、Lys239、Lys341、Lys466的拮抗效果較弱，但分界依然明顯（圖A～E）。因此，需進一步對上述17株細菌的拮抗活性成分發酵復篩。

2.2 拮抗細菌的搖瓶發酵復篩結果

由表1可知，17株細菌中有4株抑菌圈直徑達31～35 mm，5株抑菌圈直徑達21～30 mm，6株抑菌圈直徑達11～20 mm，2株細菌抑菌效果未檢出。其中菌株Lys67、Lys138、Lys375發酵液上清在未接種的培養基上清（CK）中無抑菌作用。發酵液抑菌效果非常明顯（圖1F）。

3 討論

水稻紋枯病是國內外最難治理的真菌病害之一。該病對國內的主要防治藥劑井岡霉素已產生明顯的抗藥性，過去因長期大量使用農藥造成自然生態環境污染及稻米農藥殘留量增加的問題日益突出。因此，開展該病的生物防治研究或者研究新型抗生素具有十分重要的意義，有關報道水稻紋枯病的拮抗菌中細菌主要為芽孢桿菌和假單胞菌，真菌主要為木霉，放線菌主要為鏈霉菌[6-7]，這與該研究結論一致。上述拮抗菌中，細菌和鏈霉菌適宜在土壤中生長，木霉菌適宜在非活體的木質纖維組織中生長，而紋枯病主要通過侵染活體稻株而致病，因此通過拮抗菌防治紋枯病的發生有一定的局限性。為此，筆者在實驗室條件下探索了芽孢桿菌Lys67發酵產生的活性成分對紋枯病的抑菌效果，該菌株發酵生產抑制水稻紋枯病的活性成分的工藝簡單，培養基廉價，周期較短，為進一步探索水稻紋枯病的拮抗菌及其代謝產物田間防治劑奠定了基礎。

參考文獻

[1] 李濤，路雪君，廖曉蘭，等.水稻紋枯病的發生及其防治策略[J].江西農業學報，2010，22（9）：91-93.

[2] 賴開平，葉一強，方峰，等.50%丙環唑左旋松油醇乳油對水稻紋枯病的田間防治效果[J].安徽農業科學，2009，37（31）：15297-15298.

[3] 孟德超，紀明山.遼寧地區水稻紋枯病拮抗細菌的分離和篩選[J].河南農業科學，2009（4）：79-81.

[4] 宋雯雯，覃強，田甜.稻瘟病菌拮抗微生物的篩選[J].農業科學研究，2009，30（2）：14-17.

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[7] 姚英娟，曾小軍，舒平平，等.有機水稻病蟲害防控措施研究進展[J].江西農業學報，2010，22（10）：80-82.