東亞砂蘚甘油醛—3—磷酸脫氫酶基因的克隆及表達分析

摘要 [目的] 克隆東亞砂蘚甘油醛3磷酸脫氫酶基因RjGAPDH，并對其進行生物信息學和表達分析。[方法] 通過分析東亞砂蘚轉錄組測序數據，利用RTPCR技術克隆該基因的全長序列，并通過熒光定量PCR分析RjGAPDH基因在不同干旱脅迫時間的表達情況。[結果] 該基因全長為1 208 bp，開放閱讀框1 053 bp，編碼350個氨基酸，預測蛋白分子量為38.66 kD，等電點 pI 為 6.02，不穩定系數為23.97，為穩定蛋白；該基因編碼的蛋白無跨膜區和信號肽序列，定位于細胞質。在快速干旱脅迫處理過程中，東亞砂蘚RjGAPDH基因的表達量高于正常生長的材料（CK），能被誘導表達。[結論] RjGAPDH基因可能參與東亞砂蘚對干旱的脅迫反應，為后續進一步研究其功能特征奠定基礎。

關鍵詞 東亞砂蘚；RjGAPDH；基因克隆；表達分析

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）25-08506-05

Abstract [Objective] The research aimed to clone glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase gene RjGAPDH， and analyze its bioinformation and expression. [Method] Based on RNASeq databases of Racomitrium japonicum， RjGAPDH gene was cloned by RTPCR， and the expression of RjGAPDH in different times under quick dry was detected by realtime PCR. [Result] The full length cDNA sequence of RjGAPDH gene was 1 208 bp in length， and contained a 1 053 bp open reading frame which encoded a protein of 350 amino acids， molecular weight was 38.66 kD and theoretical pI was 6.02. The predicted RjGAPDH protein belonged to stable protein， located in cytoplasm without transmembrane protein and signal peptide. In the proceed of quick dry， RjGAPDH gene could be induced， and the expression level was higher than that in CK. [Conclusion] RjGAPDH gene was speculated to participate the stress reaction of Racomitrum japonium， and the results laid the foundations for the further study on its function.

Key words Racomitrium japonicum； RjGAPDH； Gene clone； Expression analysis

甘油醛3磷酸脫氫酶（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenas，GAPDH）是糖酵解、糖異生和卡爾文循環途徑中的關鍵酶[1]，參與糖酵解過程中第一個 ATP 的形成，是維持生命活動能量形成的基本酶類之一[2-3]。GAPDH存在于所有生物中，高度保守，且在細胞中含量豐富，占總蛋白的10%～20%[4]。由于GAPDH在生物體不同組織和細胞中高豐度表達且非常穩定，因此，一直以來被人們當作“管家”基因，用作研究目標基因相對表達的內參對照[5]。但隨著研究的深入發現，當外界環境發生改變時（如無氧脅迫，傷害，高溫，高鹽堿和干旱），GAPDH在mRNA和蛋白質水平上也會隨之發生改變，并大量積累表達[6-7]，表明其與抗逆代謝有一定的關聯，且可以定位于除細胞質之外的質膜、細胞核、多聚體、內質網與高爾基體上，功能呈現多樣性[8-9]。目前，已從許多植物中克隆得到GAPDH基因，并對其開展參與逆境脅迫的分子響應機制研究[3，6，10-16]，發現其在增強植物抗旱性方面具有一定的功能[17-18]。

東亞砂蘚（Racomitrium japonicum）隸屬于紫萼蘚科（Grimmiaceae）砂蘚屬（Racomitrium），生于低海拔地區的巖面、巖面薄土和砂地面上，有時見于石壁上或近樹基部地上，在我國南北多省區廣泛分布[19]。東亞砂蘚在干燥狀態下呈休眠狀態，復水后可短時間內恢復生活力，是典型的耐旱蘚類，但有關與其抗旱性相關的分子生物學研究很少。筆者對東亞砂蘚轉錄組測序數據進行分析，發現1條與GAPDH基因同源性較高的基因序列，以此設計引物，克隆獲得該基因的全長序列，并對其生物信息學和快速干旱脅迫下的表達情況進行了分析，為深入研究GAPDH基因的抗旱功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東亞砂蘚采于黑龍江省五大連池風景區。材料采回后進行組織培養試驗，以獲得的無菌組培苗作為后續試驗材料。

選取生長旺盛、高約1.5 cm的無菌組培苗植株，用鑷子快速將附著根部的培養基去除，放入平皿中，分2部分處理。一部分直接用液氮速凍，放入-80 ℃冰箱保存，用于RjGAPDH基因的克隆。另一部分用硅膠進行快速干旱處理，處理時間為10、20、30和60 min，同時以未經處理的材料作為對照（CK），液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存，用于RjGAPDH基因的表達驗證分析。

RNAse抑制劑、DNaseⅠ購自Promega公司；Oligo（dT）15、dNTP和MMLV反轉錄酶購自Invitrogen公司；pMD 18T載體、DNA Marker購自Takara公司；Sso Fast TM Evagreen Supermix購自BioRad公司；大腸桿菌E.coli DH5α由齊齊哈爾大學遺傳學實驗室保存；其他生化試劑均購自上海生工生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；熒光定量表達分析于BioRad公司的CFX96儀器上進行。

1.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

參照宋曉宏等[20]和沙偉等[21]方法提取上述樣品的總RNA，用NanoDrop 2000微量紫外分光光度計測定樣品的濃度和OD260/OD280，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。為防止總RNA中殘留的基因組DNA干擾后續試驗，利用Promega公司的DNase I對總RNA進行純化。以總RNA為模板，以Oligo（dT）15為反轉錄引物，用MMLV反轉錄酶合成cDNA第一鏈，具體方法參照MMLV試劑盒說明書進行。

3 討論

甘油醛3磷酸脫氫酶在高等植物中以2種形式存在，一種是由GAPA和GAPB 2個亞基組成的存在于葉綠體中的GAPDH，主要參與卡爾文循環；一種是由4個同種亞基GAPC組成的存在于細胞質中的GAPDH，主要參與糖酵解和糖異生過程。GAPA和GAPB的同源性較高，可達80%，而GAPC與兩者的同源性較低，小于45%[22]。該研究通過RTPCR法從東亞砂蘚中克隆得到含完整編碼序列的RjGAPDH基因全長序列，對其生物信息學和同源序列分析發現，該基因編碼的氨基酸序列具有Gp_dh_N和Gp_dh_C 2個保守區，符合GAPC亞基的結構特征，且亞細胞定位于細胞質，與馬鈴薯和毛果楊等植物細胞質中GAPDH基因氨基酸序列的同源性較高，因此認為該基因為位于細胞質中的GAPDH基因。

在逆境脅迫下，GAPDH可參與多種有異于糖酵解和糖異生過程中的生理生化途徑，能抵御逆境脅迫對植物造成的傷害[23]。目前，有關植物GAPDH基因應答逆境脅迫的報道較多。BAEK等[24]將GAPDH基因轉化到擬南芥原生質體中發現，該基因能強烈抑制熱脅迫時H2O2的產生和細胞的死亡。于麗麗等[14]研究發現，剛毛檉柳（Tamari hispid）在受到PEG、NaCl、CdCl2和NaHCO3脅迫時，ThGAPDH基因的表達量發生明顯變化，具有對脅迫的應答能力。張旸等[3]克隆得到星星草PtGAPDH基因，Northern雜交分析顯示，隨著Na2CO3溶液濃度的增加，PtGAPDH基因在鹽堿脅迫下葉片和根部表達量都顯著升高；超過最大耐受量后，PtGAPDH基因表達豐度逐漸降低。ZIAF等[25]發現，在干旱等各種脅迫下，野生型番茄（Solanum pennellii）的ADH和GAPDH基因能被誘導表達，而植物膜脂過氧化的程度則隨之減輕。MEREWITZ等[26]在研究含有衰老響應啟動子SAG12和IPT基因的轉基因植物匍匐翦股穎（Agrostis stolonifera）時發現，耐旱植物的葉在水分脅迫下衰老更慢，而在水分虧缺時，該植物的GAPDH 蛋白含量較高，增加了植物的抗性。齊曉花等[15]以黃瓜（Cucumis sativus）耐澇品系“早二N”為材料，研究3–磷酸甘油醛脫氫酶基因CsGAPDH時得出，CsGAPDH屬于黃瓜澇脅迫響應基因，在緩解澇脅迫傷害過程中可能具有重要的調控作用。該研究中，當東亞砂蘚受到干旱脅迫時，RjGAPDH基因明顯誘導表達，說明干旱脅迫可使糖酵解途徑增強，糖代謝能力明顯加強，有一定的抗脅迫功能，推測該基因可能參與了東亞砂蘚的抗逆調控并發揮作用。

為明確RjGAPDH基因的功能，正在進行遺傳轉化模式植物的研究，為進一步研究東亞砂蘚的抗旱機制提供參考。

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