枇杷AmyrinSynthaseAS基因的5′RACE與3′RACE擴增及序列分析

摘要 以‘解放鐘’枇杷（Eriobotrya japonica L.）葉片為材料，在前期獲得保守區的基礎上，采用RTPCR結合RACE技術，擴增得到枇杷三萜合成途徑中關鍵酶香樹脂醇合成酶基因的5′和3′序列，并進行序列分析。結果表明，AS基因5′非編碼區長96 bp；3′非編碼區長321 bp，在GenBank中更新的登錄號為JX173279.2，結合已發表保守區序列，通過拼接，得到AS基因全長2 700 bp，含有一個2 283 bp的開放閱讀框，編碼760個氨基酸。生物信息學分析表明，該蛋白是定位于細胞核的蛋白，具有29個磷酸化位點，屬于ISOPREN_C2_like超家族，含有Camelliol C synthase、squalene/oxidosqualene cyclases、 Squalene cyclase多結構域，與蘋果AS基因98%同源。

關鍵詞 枇杷；香樹脂醇合成酶基因；基因克隆；序列分析

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）25-08499-03

Abstract 5′cDNA and 3′cDNA of AS （Amyrin systhase Gene）， which was an important enzyme of terpenes synthesis were cloned with RTPCR and RACE from Eriobotrya japonica L. leaves on the basis of the gene conserved region we obtained. And then， the sequence was analyzed. The results showed that： the full length of ejAS mRNA （Updated GenBank accession number， JX173279.2）， about 1 775 bp， consisted of an Open Reading Frame of 1 239 bp， and 5' and 3' untranslated regions of 97 bp and 439 bp， respectively. The putative protein had 760 amino acids， and the identity to that of Malus domestica was 98%， and belonged to ISOPREN_C2_like super family， contained Camelliol C synthase， squalene/oxidosqualene cyclases， Squalene cyclase multiple domains.

Key words Eriobotrya japonica L.； Amyrin Synthase gene； Gene cloning； Sequence analys

枇杷（Eriobotrya japonica L.）是薔薇科枇杷屬常綠小喬木，原產我國，是兼具觀賞性、藥用和食用價值的植物種類[1]。枇杷的果實、花、葉、樹皮、根等含有多種有效生物活性組分，其中最重要的是五環三萜類化合物——熊果酸（ursolic acid，UA）、齊墩果酸（oleanolic acid，OA）、委陵菜酸（tormentic acid，TA）、科羅索酸（corosolic acid，CA）、山楂酸（maslinic acid，MA），它們擁有相似的化學結構及大部分相同的生物合成途徑，可用于治療傷風感冒、咳嗽、慢性支氣管炎、糖尿病、高血脂、癌癥等[2]，具有重要的商業價值，市場前景廣闊[3]。目前對植物中五環三萜化合物的生物合成途徑也有了一定的了解[4-5]，已發現的位于細胞質中的PMD途徑以及位于質體中的DXP途徑。

在藥用植物西洋參[6]、甘草[7]、歐洲山芥[8]等上已經克隆得到mRNA全長序列。利用植物細胞懸浮培養技術生產次生代謝產物是目前中藥生產中極具潛力的技術路線[9-12]。另外，充分了解次生代謝產物的代謝途徑，利用基因克隆技術，基因啟動子等關鍵調控因子分離克隆技術，繼而通過基因工程技術創造高產細胞系，成為生產植物次生代謝物最具潛力的研究領域[13-15]。通過植物細胞懸浮培養技術獲得的枇杷細胞培養物中含有豐富的五環三萜化合物，并經過體外小鼠試驗表明對糖尿病、高血脂有抑制作用[16-17]。筆者基于已獲得的枇杷香樹脂醇合成酶基因的保守區序列，進一步進行5′RACE與3′RACE擴增，以期獲得完整的mRNA全長序列，為正在進行的枇杷細胞懸浮培養調控目標產物五環三萜化合物含量的試驗提供基因源。

1 材料與方法

1.1 材料

‘解放鐘’枇杷（Eriobotrya japonica L. cv.‘Jie Fang Zhong’）剛長出的覆有絨毛、未見綠色、微卷的幼葉，于2011 年12 月采自福建省莆田縣果樹研究所。

1.2 方法

1.2.1 枇杷葉片RNA的提取。總RNA的提取采用北京天恩澤公司的柱式植物RNAOUT 2.0，參考試劑盒說明書提取。

1.2.5 序列分析及生物信息學分析。引物設計、序列及分析采用DNAMAN軟件，mRNA核酸序列推導的氨基酸序列生物信息學分析采用ExPASy ProtParam，NCBICDS，PSORT TMHMM2.0 SignalP，Jpred，Coils，NetPhos 2.0，Gene Ontology annotation等在線軟件，具體參考李惠華等[18]方法。

2 結果與分析

2.1 枇杷AS基因的RACE擴增結果

提取的枇杷葉片總RNA電泳顯示條帶清晰完整（圖1A），OD260/OD280=2.02，可以用于后續試驗。

在已獲得的保守區[19]基礎上，以5′RACE的cDNA為模板，巢式PCR電泳結果顯示，經2輪PCR之后擴增出大小約900 bp的單一DNA片段（圖1C）。經過測序、軟件分析，確認此片段大小為888 bp，與保守區序列有272 bp的重疊片段（黑色區域見圖2），表明此片段是龍眼胚性愈傷組織AS的mRNA 5′端序列。

以3′RACE的cDNA為模板，巢式PCR電泳結果顯示，經過2輪PCR后擴增出與預期目標片段相符約1 200 bp的單一條帶（圖1B），經克隆測序以及結合保守區已有序列分析，與保守區序列有162 bp的重疊片段（灰色區域見圖2），確認此片段大小為1 228 bp，是枇杷AS的mRNA 3′端序列。

將3′RACE和5′RACE的產物進行序列拼接，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在2 700 bp左右得到單一條帶，且條帶清晰完整（圖1D）。陽性克隆送北京六合華大生物公司進行測序。利用生物軟件DNAMAN5.0對測序結果進行序列比對得到枇杷AS基因全長序列。該基因命名為ejAS基因，全長2700bp，包含2 283個開放閱讀框，共編碼760個氨基酸，5′端非編碼區序列96 bp，3′端非編碼區序列321 bp，3′poly（A）尾長18 bp。將該3′端序列和5′端序列在GenBank數據庫保守區登錄序列（登錄號為JX173279.1）中補充輸入，登錄號更新為JX173279.2。序列見圖2。

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