高效液相色譜測定食品中的黃曲霉毒素

摘要 [目的]建立液相色譜對食品中的4 種黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2 進行定性和定量分析的檢測方法。[方法]試樣經(jīng)過甲醇+水提取，濾液經(jīng)過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析柱凈化，以甲醇通過免疫親和層析柱洗脫，通過帶熒光檢測器的高效液相色譜儀柱后碘溶液衍生測定黃曲霉毒素的含量。[結(jié)果]試驗表明，4 種黃曲霉毒素在3.0～30.0 ng/ml和10.0～50.0 ng/ml質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999；4 種黃曲霉毒素的檢出限均為0.25 μg/kg。在3個不同的加標(biāo)水平下，4 種黃曲霉毒素的回收率在70%～99%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為分別為1.7%～7.6%。 [結(jié)論]該方法能有效檢測出多種食品中4 種黃曲霉毒素的殘留量，且穩(wěn)定性好，結(jié)果可靠。

關(guān)鍵詞 黃曲霉毒素；液相色譜；免疫親和層析；熒光檢測

中圖分類號 S609.9 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）25-08743-02

Abstract [Objective] A liquid chromatography method was established for the simultaneously qualitative and quantitative analysis of aflatoxins B1， B2， G1 and G2. [Method] Samples were sequentially extracted by methanolwater， cleaned up with immunoaffinity chromatography column， tested by fluorescence detection and post column derivatization of iodine solution. [Result] The results showed that the method showed good linear relationships in the range of 3.0-30.0 ng/ml and 10.0-50.0 ng/mlL， with correlation coefficients no less than 0.999. Their quantitation limits were 0.25 μg /kg. The mean recoveries ranged from 70% to 99% with relative standard deviations of 1.7%-7.6%. [Conclusion] The proposed method was sensitive and reliable， and was successfully applied in the determination in food.

Key words Aflatoxins； Liquid chromatography； Multifunctional cleaning column； Fluorescence detection

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFT）是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌代謝產(chǎn)生的一類有毒的真菌毒素[1-5]，廣泛存在于各種食品、農(nóng)產(chǎn)品和飼料中，嚴(yán)重污染著花生、玉米、大米、小麥等糧油產(chǎn)品，甚至堅果、乳制品、酒類和調(diào)味品等一些常見食品中也能經(jīng)常發(fā)現(xiàn)有黃曲霉毒素。目前已分離出黃曲霉毒素及其衍生物有20 多種，其中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、B2a、G2a、GM1、R0和毒醇等十余種結(jié)構(gòu)已確定。黃曲霉毒素均無色、無嗅、無味，在紫外照射下能發(fā)出強烈的熒光。根據(jù)發(fā)射的熒光顏色不同，黃曲霉毒素分為B 族（ 發(fā)藍(lán)色熒光，取英文“blue”之首字母） 和G族（ 發(fā)綠色熒光，取英文“green”之首字母） 兩大類。

黃曲霉毒素是一種毒性極強的劇毒物質(zhì)，其毒性、致癌性、致突變性、致畸性在所有的真菌毒素中居首位；不僅毒性大、分布廣，結(jié)構(gòu)也比較穩(wěn)定，在食物的熱加工過程中都不易被破壞。因其對人體健康危害巨大，給消費者的飲食安全埋下了巨大隱患，各國政府及相關(guān)組織紛紛制定了食品中黃曲霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)和相應(yīng)的檢測方法。我國在食品中真菌毒素限量GB 2761-2005版和2011版中，分別規(guī)定了花生、玉米、大米、植物油、豆類、發(fā)酵食品以及乳制品中黃曲霉毒素B1、M1的限量值；歐盟在2010 年的2月27日頒布的EUNo165/2010 號法規(guī)中，規(guī)定了谷物、油籽、調(diào)味料和堅果中的黃曲霉毒素含量的最高限量：規(guī)定了除玉米和大米之外，在谷物和由谷物制備的產(chǎn)品中的最高限量是2 μg/kg，而B1、B2、G1和G2的總和不能超過4 μg/kg[6-10]。

近幾年，我國出口歐盟被通報的產(chǎn)品中有黃曲霉檢出的食品大多為堅果類產(chǎn)品、谷物及其制品，導(dǎo)致我國產(chǎn)品遭受通報的主要原因是限量標(biāo)準(zhǔn)的不統(tǒng)一。因此，筆者建立液相色譜對食品中的4 種黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2 進行定性定量分析的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料 主要儀器：高效液相色譜儀，配熒光檢測器和柱后衍生裝置；固相萃取裝置；玻璃注射器（20 ml）；玻璃試管；黃曲霉毒素免疫親和柱，購自泰樂祺科技有限公司。主要試劑：甲醇為色譜純；氯化鈉、碘為分析純；水為去離子水；黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品購自上海安譜試劑公司。

1.2 樣品的處理

準(zhǔn)確稱取經(jīng)過粉粹的試樣25.0 g于250 ml具塞錐形瓶中，加入5.0 g氯化鈉及甲醇+水125 ml，振蕩30 min提取，2 5000 r/min，離心5 min，定量濾紙過濾，量取上清液15 ml，加入30 ml水稀釋，搖勻，用玻璃纖維濾紙過濾，備用。

將免疫親和柱連接于20.0 ml玻璃注射器下。將上述濾液15.0 ml樣品提取液注入玻璃注射器中，在重力作用下通過免疫親和柱，20 ml純水分2次淋洗免疫親和柱。棄去全部流出液，用5 ml注射器并使2.5 ml空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入1.0 ml色譜級甲醇洗脫，在重力作用下收集全部洗脫液于玻璃試管中，供LC測定。

2.3 凈化條件的確定

該試驗中使用含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析柱凈化，此抗體對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有專一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上，以甲醇通過免疫親和層析柱洗脫。在凈化之前應(yīng)將樣品提取液經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾，除去雜質(zhì)；凈化時將2.5 ml空氣通過柱體，保證柱子干燥。這一步操作比較關(guān)鍵，一定要注意。

2.4 柱后衍生 該試驗中使用0.05%碘溶液作為衍生溶液，衍生溶液流速為0.2 ml/min，反應(yīng)管溫度為70 ℃。使用柱后衍生法黃曲霉毒素的熒光強度明顯增加，靈敏度提高，檢測效果比較理想。

3 結(jié)論

該試驗建立了能同時檢測食品中黃曲霉毒素的高效液相色譜檢測方法，方法的回收率在70%～99%，提取效果好，靈敏度高，重復(fù)性好。實際樣品檢測結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定可靠，靈敏度高，適用于該類樣品的檢測。

參考文獻

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