懸浮培養(yǎng)法分離人前列腺癌PC—3細(xì)胞系類干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

摘要：目的 從人前列腺癌PC-3細(xì)胞系中分離鑒定前列腺癌干細(xì)胞。方法 分別用含血清及無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞系PC-3細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中前列腺癌類干細(xì)胞的比例。結(jié)果 PC-3細(xì)胞可以在無血清培養(yǎng)液中生存并形成可以穩(wěn)定傳代的懸浮細(xì)胞球，細(xì)胞中CD44+、CD133+及SP細(xì)胞比例均顯著高于PC-3貼壁細(xì)胞的比例。結(jié)論 通過無血清懸浮聚球培養(yǎng)可以從PC-3細(xì)胞中簡便、高效地分離出前列腺癌類干細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：前列腺癌；懸浮培養(yǎng)法；干細(xì)胞

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一，通過手術(shù)切除、放療和內(nèi)分泌治療等。傳統(tǒng)治療手段雖然可以獲得較好的早期療效，但并不能完全阻止前列腺癌的進(jìn)展和復(fù)發(fā)。腫瘤干細(xì)胞（tumor stem cells，TSC）被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源[1]。已有學(xué)者分別從乳腺癌和腦腫瘤等實(shí)體瘤中成功分離出相應(yīng)的TSC。本文采用添加了生長因子的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)前列腺癌類干細(xì)胞，再通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)其中具有干細(xì)胞特性的陽性細(xì)胞比例，并進(jìn)一步鑒定其增殖等特性，從而為進(jìn)一步深入研究人前列腺癌干細(xì)胞（human prostate cancer stem cell，hPCSC）奠定基礎(chǔ)，為前列腺癌的臨床診治提供新的思路。

1資料與方法

1.1一般資料 人前列腺癌PC-3細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。含血清培養(yǎng)基（serum-supple-mented medium， SSM）為含10%特級(jí)胎牛血清（中國BD公司）的DMEM/F12（1B1，美國Invitrogen/Gibc公司）培養(yǎng)基，并添加2 mmol/L L-谷氨酰胺（美國Sigma公司）；無血清培養(yǎng)基（serum-free medium， SFM）為不含胎牛血清的DMEM/F12（1B1）培養(yǎng)基，并添加2 mmol/L L-谷氨酰胺、人表皮生長因子（human epidermal growth factor，EGF）、人堿性成纖維生長因子（human basic fibroblast growth factor，bFGF）等。流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司）、全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）等均由中科院昆明動(dòng)物研究所提供。

1.2方法

1.2.1前列腺癌PC-3細(xì)胞的培養(yǎng) 將PC-3細(xì)胞接種于50 mL玻璃培養(yǎng)瓶，添加SSM，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2前列腺癌類干細(xì)胞球的培養(yǎng)分化 將處于對(duì)數(shù)生長期的貼壁細(xì)胞進(jìn)行消化、重懸于SFM中，每個(gè)培養(yǎng)皿懸浮培養(yǎng)1×104個(gè)細(xì)胞，每天間斷搖動(dòng)培養(yǎng)皿，以阻止細(xì)胞貼壁，半量換取培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，更換1次/2～3 d。待培養(yǎng)皿中細(xì)胞增殖、形成懸浮細(xì)胞球后進(jìn)行收集，吹打成單細(xì)胞懸液并按1∶2傳代。分別于細(xì)胞接種后5 d、10 d、15 d統(tǒng)計(jì)直徑超過60 um的懸浮細(xì)胞球數(shù)目，選取5個(gè)連續(xù)視野，用平均法計(jì)算PC-3懸浮細(xì)胞球的形成率。每2～3 d向形成懸浮細(xì)胞球的SFM中滴加FBS，在SSM和SFM中交替培養(yǎng)PC-3成球細(xì)胞，觀察并記錄PC-3成球細(xì)胞的生長方式。

1.2.3流式細(xì)胞學(xué)分選CD44+、CD133+及SP細(xì)胞 以PC-3懸浮成球細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，以PC-3單層貼壁細(xì)胞為對(duì)照組。將兩種細(xì)胞重懸為單細(xì)胞懸液，進(jìn)行染色。應(yīng)用熒光激活細(xì)胞分選法和紫外光激發(fā)后雙波長分析法檢測(cè)CD44+、CD133+及SP細(xì)胞比例。染色嚴(yán)格依照廠商說明書上標(biāo)示的操作流程。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)（n）或率（%）表示，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1前列腺癌類干細(xì)胞球的形成 將前列腺癌PC-3細(xì)胞接種于SFM后，大多數(shù)細(xì)胞呈懸浮生長狀態(tài)，發(fā)生凋亡的細(xì)胞為極少數(shù)。接種3 d后少量體積較小的腫瘤細(xì)胞集成球團(tuán)，球團(tuán)大小不等，由5～15個(gè)PC-3細(xì)胞組成，圓形、具有折光性，結(jié)合松散。5～6 d后，懸浮的腫瘤細(xì)胞球團(tuán)增多增多，細(xì)胞間結(jié)合較緊密。培養(yǎng)1 w后，細(xì)胞球團(tuán)的變成圓形，細(xì)胞球團(tuán)上有新生細(xì)胞生長，出芽方式生長為主。約7 d傳代，傳代后的細(xì)胞約4 d后形成新的不規(guī)則細(xì)胞球，以后逐漸變得規(guī)則。

2.2 PC-3懸浮成球細(xì)胞的自我更新與分化 收集PC-3懸浮細(xì)胞球，吹散、重懸為單細(xì)胞懸液后再次接種于SFM中，5～7 d后仍可形成細(xì)胞球。經(jīng)連續(xù)傳代，細(xì)胞球形成率基本穩(wěn)定（P>0.05）。在SFM中滴加FBS后細(xì)胞球變小，底部邊緣細(xì)胞從細(xì)胞球中貼壁快速生長，7 d后基本上看不到細(xì)胞球，完全顯示為貼壁生長的單細(xì)胞。

2.3 PC-3懸浮成球細(xì)胞中CD44+、CD133+細(xì)胞和SP細(xì)胞的比例 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，PC-3懸浮成球細(xì)胞CD44+、CD133+細(xì)胞的比率為9.62%，SP細(xì)胞比率為2.19%，均高于貼壁細(xì)胞，差異具有顯著性（P<0.05）。

3討論

隨著環(huán)境的污染，前列腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，其病死率也在逐年上 升[2]。前列腺癌的治療以手術(shù)切除為主，結(jié)合放療和內(nèi)分泌治療，有一定的療效，但部分前列腺癌進(jìn)展為雄激素非依賴性前列腺癌（androgen independent prostate cancer，AIPC），目前臨床尚無有效的治療方法，大量文獻(xiàn)證實(shí)前列腺癌干細(xì)胞是引發(fā)雄激素非依賴性前列腺癌的原因之一[3]。腫瘤干細(xì)胞可自我更新、多向分化和無限增殖，是形成腫瘤的起始細(xì)胞并維持腫瘤的生長，其對(duì)化療、放療均不敏感[4]?，F(xiàn)有的治療手段只以殺滅前列腺癌細(xì)胞，無法殺滅前列腺癌干細(xì)胞，導(dǎo)致前列腺癌繼續(xù)進(jìn)展。并且前列腺癌干細(xì)胞比例極低，分化快，缺乏特異性標(biāo)志物，嚴(yán)重阻礙了對(duì)其表型、功能及遺傳學(xué)特征的深人研究。

本研究通過將前列腺癌PC-3細(xì)胞置于SFM中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)未分化的前列腺癌PC-3細(xì)胞能形成前列腺癌類腫瘤干細(xì)胞球團(tuán)，而大部分已分化的前列腺癌PC-3細(xì)胞相繼凋亡；培養(yǎng)時(shí)間越長，前列腺癌干細(xì)胞球團(tuán)呈增大狀態(tài)，7 d傳代后可繼續(xù)增殖，形成新的細(xì)胞球，證明前列腺癌類干細(xì)胞可自我更新及增殖。CD44+和CD133+是前列腺癌干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。我們通過檢測(cè)PC-3懸浮成球細(xì)胞CD44mRNA和CD133mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別是PC-3單層貼壁細(xì)胞的數(shù)倍，提示成球細(xì)胞中富集了前列腺癌干細(xì)胞。SP細(xì)胞存在于多種成體組織、胚胎細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中，具有自我更新和多向分化潛能，是一種干細(xì)胞樣的細(xì)胞群，可以在體內(nèi)分化成不同組織類型的細(xì)胞。分選SP細(xì)胞分選可以分離和鑒定腫瘤干細(xì)胞，不需要特定的細(xì)胞表面標(biāo)記物。本研究中，SP細(xì)胞比率為2.19%，和Oates（2009）等[5]研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，采用懸浮培養(yǎng)法分離人前列腺癌PC-3細(xì)胞系類干細(xì)胞，簡便、高效，可進(jìn)一步研究前列腺癌干細(xì)胞生物學(xué)特性，為臨床診斷及治療前列腺癌提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)和幫助。

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[4]Ottinger S， Kloppel A， Rausch V， et al. Targeting of pancreatic and prostate cancer stemcell characteristics by Crambe crambe marine sponge extract[J].Int J Cancer，2012，130（7）：1671-1681.

[5]Oates JE， Grey BR， Addla SK， et al. Hoechst 33342 side population identification is a conserved and unified mechanism in urological cancers[J].Stem Cells Dev，2009，18（10）：1515-1522.編輯/肖慧