三種鑒定葡萄球菌凝固酶方法的比較

摘要：目的 評價3種鑒定葡萄球菌凝固酶方法的敏感性和特異性。方法 臨床分離的110株葡萄球菌，經過革蘭染色，顯色培養(yǎng)基顯色培養(yǎng)，觸酶試驗，VITEK32鑒定后，用試管法、玻片法、商品乳膠血凝法（slidex staph-kit），鑒定葡萄球菌和評價凝固酶試驗方法。3種方法結果不一致的菌株進行重復試驗。用兔血漿試管法作為標準，比較其它凝固酶方法的敏感性、特異性。結果 兔血漿試管法檢測到65株陽性菌株，以此為標準，兔血漿玻片法有3株假陽性，人血漿玻片法和乳膠血凝法的假陽性分別為8株和2株。人血漿試管法的鑒定符合率為100%，其余各種方法的敏感性均為100%，而特異性（兔血漿和人血漿玻片法，乳膠凝集試驗）分別為95.6%，88%，和98.5%。結論 人血漿凝固酶試管法敏感性特異性均較高，是鑒定葡萄球菌凝固酶試驗的好方法，適合于各基層臨床實驗室對葡萄球菌的鑒定。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌；血漿凝固酶；乳膠試劑

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是醫(yī)院內感染的重要病原菌，然而臨床標本中金黃色葡萄球菌鑒定中往往困擾者廣大檢驗工作者，血漿凝固酶試驗是鑒定金黃色葡萄球菌的重要方法之一。鑒定的準確性直接關系到進一步上機鑒定及藥敏試驗判斷及MRS紙片法篩選判斷。凝固酶分為兩種：游離性凝固酶，結合型凝固酶，游離型凝固酶常用試管法鑒定，結合型凝固酶常用玻片法鑒定。隨著現(xiàn)代微生物技術的不斷發(fā)展，許多醫(yī)院開始選用法國梅里埃公司生產的葡萄球菌乳膠凝集試劑作為檢出金黃色葡萄球菌的常規(guī)篩選試驗試劑，雖然乳膠試劑盒簡便，快速，但是易出現(xiàn)假陽性且價格昂貴。為尋找一種適合廣大基層醫(yī)院實驗室對葡萄球菌鑒定經濟，簡便的鑒定方法。本文以兔血漿試管法為標準[1]，對110株臨床分離的葡萄球菌凝固酶分別進行兔血漿，人血漿凝固酶試驗和乳膠凝集試驗。評價其敏感性，特異性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 110株葡萄球菌均來自于我院2011年12月～2013年9月臨床分離菌株，保存于-20℃低溫冰箱，實驗前接種于5%羊血基礎平板，取對數(shù)生長期菌落進行試驗。

1.1.2菌株鑒定 以上所有菌株都經革蘭染色，觸酶試驗，顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)，血漿凝固酶試管法和VITEK32微生物自動鑒定。

1.1.3質控菌株 以金黃色葡萄球菌ATCC25923作為陽性對照菌株，表皮葡萄球菌ATCC26069為陰性對照菌株。購于云南省臨床檢驗中心。

1.1.4其它試劑、材料

1.1.4.1兔血漿，上海市疾病控制中心生產商品試劑（批號：20130129）。

1.1.4.2乳膠試劑盒 （slidex staph-kit）法國梅里埃公司生產。

1.1.4.3人血漿制備 取30例外觀清亮體檢（肝、腎功，血糖、血脂均正常）肝素抗凝血制備成混合血漿低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4.4其它材料 所用試管、燒杯均洗凈后高壓滅菌消毒后備用，玻片均用新玻片消毒滅菌后備用。

1.2方法 將葡萄球菌接種于血平板，經過18～24h 培養(yǎng)后，分別采用兔血漿，人血漿，乳膠試劑進行試驗。

1.2.1玻片法試驗 取1滴生理鹽水置玻片上，挑取待測細菌，在生理鹽水中制成菌懸液；取血漿1滴置玻片上與菌懸液混勻，10s內見到明顯凝塊，而生理鹽水中無凝集現(xiàn)象者為陽性；試驗同時做陽性，陰性對照[2]。

1.2.2試管法試驗 混合血漿用生理鹽水稀釋4倍，取0.5ml加被鑒定葡萄球菌數(shù)個菌落，混合后放35℃孵箱，3～4h記錄結果，若陰性，然后再放置24h，再觀察記錄結果。觀察時，將試管從垂直位緩慢傾斜90°，觀察試管中凝集的形成。同時做陰性、陽性對照。

1.2.3膠凝集試驗 先將致敏的乳膠顆粒試劑充分混勻，在一次性卡片的兩個不同區(qū)域各加1滴致敏試劑，然后用接種環(huán)挑取待測的葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物加入試驗區(qū)，對照區(qū)則加1滴對照試劑，輕輕混勻、乳化，觀察結果。30s內，試驗側凝集，而對照側無凝集時，可判斷為陽性。試驗同時做陽性、陰性對照。其他所有操作方法均按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[3]執(zhí)行。

2 結果

2.1三種方法檢測葡萄球菌的結果見表1。

2.2 以兔血漿試管法為標準，比較其它試驗方法的敏感性和特異性（見表2）。

2.3從以上可知3種方法檢出凝固酶陽性的葡萄球菌除人血漿玻片法檢出率較高外66.4%，其它方法的檢出率均無太大差異。兔血漿試管法檢測到65株陽性菌株，以此為標準，兔血漿玻片法有3株假陽性，人血漿玻片法和乳膠血凝法的假陽性分別為8株和2株。人血漿試管法的鑒定符合率為100%，其余各種方法的敏感性均為100%，而特異性（兔血漿和人血漿玻片法，乳膠凝集試驗）分別為95.6%，88%，和98.5%。

3 討論

金黃色葡萄球菌是常見的致病菌，正確鑒定金黃色葡萄球菌較為重要。血漿凝固酶試驗是檢測金黃色葡萄球菌的關鍵。致病性較強的金黃色葡萄球菌可產生凝固酶，使血漿中的纖維蛋白原轉變成纖維蛋白，附著于細菌表面成塊，凝塊包繞細菌，使其免遭抗生素，抗體，吞噬等多種因素的作用。葡萄球菌有兩種凝固酶，一種是與細菌細胞壁結合的凝固酶，即凝集因子，它可直接作用于纖維蛋白原，可用玻片法檢出；另外一種是菌體釋放到培養(yǎng)基中的游離凝固酶，它可以與血漿中的凝固酶反應因子協(xié)同作用于纖維蛋白原，使血漿凝固，故可用試管法檢出。凝集因子試驗和血漿凝固酶試驗是兩個不相關試驗，兩者不能相互代替，也不可以相互印證。

本次試驗可以看出除血漿凝固酶試管法沒有假陽性外，其它方法都存在假陽性。血漿凝固酶玻片放的假陽性明顯較高（兔血漿68例，人血漿73例），其特異性較差。原因可能是由于人血漿中產生的自身抗體或血漿中的抗凝劑所致。所以在玻片法檢測結合型凝固酶時，應注意用蒸餾水代替生理鹽水稀釋血漿，因為葡萄球菌對鹽敏感，特別是不能使用高鹽培養(yǎng)基，血漿不能過多，一般是1滴，1接種環(huán)血漿，4接種環(huán)蒸餾水混勻，可減少假陽性的出現(xiàn)。

乳膠凝集試驗中也存在著假陽性，可能是因為金黃色葡萄球菌細胞壁中的蛋白A含量過高而導致假陽性的出現(xiàn)[4]。乳膠凝集試驗是用提純IgG的FC段與金黃色葡萄球菌蛋白A（SPA）結合，反應機制是雙鏈式，所以避免了某些金黃色葡萄球菌游離凝固酶或SPA產生足主所致的假陰性；它用于檢測凝集因子和蛋白質A的乳膠混合血漿試劑，大大地提高了檢測凝集因子的特異性。

而此次試驗中試管法檢測葡萄球菌凝固酶的敏感性與特異性均較高，并且人血漿與兔血漿所檢出凝固酶陽性葡萄球菌菌株符合率為100%，無假陽性與假陰性出現(xiàn)。主要是由于試管法檢測的是游離型凝固酶，是菌體釋放到培養(yǎng)基中的，它可以與血漿中的凝固酶反應因子協(xié)同作用于纖維蛋白原使血漿凝固，但是試驗中血漿應做4倍稀釋，結果觀察應在35℃溫育24h后。

從此次試驗可知，在快速鑒定葡萄球菌時，應選用兔血漿作玻片法凝固酶試驗或選用乳膠試劑做鑒定，但不能作為確證試驗。人血漿凝固酶試管法敏感性特異性均較高，是鑒定葡萄球菌凝固酶試驗的好方法，適合于各基層臨床實驗室對葡萄球菌的鑒定。

參考文獻：

[1]張紅升.三種鑒定葡萄球菌凝固酶方法的評價[A].實用醫(yī)技雜志，2007，1（2）：256-257.

[2]高屹.如何做好葡萄球菌凝集因子試驗[J].中華醫(yī)學檢驗雜志，1999，22（增刊）：43.

[3]葉應嫵，王毓三.全國臨床檢驗操作規(guī)程[M].2版.南京：東南大學出版社，1992：182-183.

[4]李少茵，劉賜敏，金黃色葡萄球菌鑒定影響因素的研究[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，2006，33（6）：993-994.

編輯/王敏