慢性氟中毒誘發(fā)大鼠腎臟損傷機制的研究

摘要：目的 探討慢性氟化鈉中毒大鼠腎臟損傷的作用機理。方法 通過給大鼠自由飲用含有不同劑量氟化鈉煮沸冷卻自來水4個月，制備慢性氟中毒模型，測定其血清中尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平，同時檢測各組大鼠腎臟總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）活力和谷胱甘肽（GSH）的活力含量。結(jié)果 氟化鈉慢性中毒各組尿氟和血氟含量均比正常對照組增高（P<0.01），并且中、高劑量組大鼠血清BUN、Cr活性增高（P<0.01）；氟化鈉各劑量組大鼠腎臟MDA含量均顯著高于正常對照組（P<0.01），S0D和T-AOC活性顯著下降（P<0.01），同樣中、高劑量組GSH含量活性顯著下降（P<0.01）。結(jié)論 自由基水平增高誘發(fā)脂質(zhì)過氧化可能是氟致大鼠腎臟損傷的重要機制之一。

關(guān)鍵詞：氟化鈉；慢性氟中毒；腎臟；自由基；脂質(zhì)過氧化；大鼠

長期以來，氟中毒主要損害牙齒、骨骼等骨性組織已十分明確，而對內(nèi)臟的損害卻未能引起起臨床學和病理學醫(yī)生的重視。氟是機體重要的微量元素之一，但攝入過量能引起廣泛的全身性病變，其作用機理至今尚不清楚。近年來，氟中毒引起的非骨相損害越來越引起國內(nèi)外學者的關(guān)注，慢性氟中毒是嚴重危害人類健康的全身性疾病，腎臟是氟排除的主要器官，也是氟中毒的靶器官之一，但氟中毒的病理機制十分復雜，目前尚無一致的解釋。有研究報道，氟中毒的病理機制可能與其在機體造成自由基堆積、氧化損傷增強，抗氧化酶活性降低有關(guān)[1，2]。機體慢性氟中毒時內(nèi)臟組織病理損傷可能與氟誘導機體脂質(zhì)過氧化作用增強有關(guān)[3]，但脂質(zhì)過氧化在氟中毒腎臟損傷中的作用機制有待進一步研究。本實驗通過制備大鼠氟化鈉慢性中毒模型，檢測氟中毒大鼠血清尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平，并觀察腎臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性以及總抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽（GSH）含量的變化，進一步探討腎臟損傷與脂質(zhì)過氧化或者自由基之間的關(guān)系，為深入研究氟中毒腎臟病變提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1實驗動物 健康Wistar大鼠，SPF級，雌雄各半，體重（100±10）g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYKG桂2003-0005。動物室溫度：（25±2）℃，相對濕度：（60±5）%。動物以廣西醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心配制的飼養(yǎng)。

1.2主要藥品和試劑 氟化鈉（北京化工廠生產(chǎn)，批號：070703）；尿素氮測定試劑盒（批號：20091114），肌酐測定試劑盒（批號：20091114），均為長春匯力生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；總抗氧化能力測定試劑盒（批號：20090918），丙二醛測定試劑盒（批號：20090918），超氧化物歧化酶測定試劑盒（批號：20090905），谷胱甘肽測定試劑盒（批號：20090905），考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒（批號：20050723）測定，均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.3主要儀器 電熱恒溫水?。ū本╅L安科學儀器廠）；低溫高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；日本東芝TBA-120FR生化分析儀（日本東芝公司產(chǎn)）；722S分光光度計（北京長源實驗設(shè)備廠）；漩渦混合器XW-80A（上海醫(yī)科大學儀器廠）；電子天平（上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠）。

1.4動物分組 健康Wistar大鼠60只，隨機分為四組，每組15只，分別分為空白對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組電針治療組。其中低、中、高劑量組大鼠分別自由飲用有含氟化鈉55、110、222mg/L的煮沸冷卻自來水，空白對照組大鼠自由飲用煮沸冷卻自來水。給藥期間稱體重1次/2w，并觀察一般狀況，有無死亡等情況，實驗周期共4個月。

1.5指標觀察與測定 實驗結(jié)束后前1d收集大鼠24h的尿液，以待測定尿氟含量；各組大鼠采用摘除眼球取血，靜置后3000r/min離心15min分離血清，采用采用氟離子選擇電極法測定尿氟、血氟含量，采用生化分析儀檢測BUN、Cr。頸椎脫臼處死大鼠，取腎臟剪碎后加入9倍生理鹽水在冰浴中制成10%（W/V）腎臟勻漿組織液，3000r/min離心15min分離上清液，于-20℃保存待測；分別采用分光光度法組織中T-AOC活力、硫代巴比妥酸染色法測定MDA含量、黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性和二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH含量，均采用南京建成生物工程研究所產(chǎn)品試劑盒，具體操作步驟嚴格按照均按照說明書操作測定。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計 統(tǒng)計計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)均在計算機中由SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。

2 結(jié)果

2.1一般狀況 空白對照組和低劑量組大鼠活動正常，體重增長正常，毛色光澤；而中、高劑量組大鼠安靜少動、體重體重增長率隨染毒劑量增加呈降低趨勢，飲水量偏多，部分大鼠毛色無光澤?？瞻讓φ战M大鼠門牙呈棕黃色，表面色澤光滑；中、高劑量組所有大鼠門齒均發(fā)生了氟斑牙，表面粗糙，光澤偏黃色，重者甚至發(fā)生牙齒缺損。實驗期間，正常對照組雌性大鼠死亡1只；中劑量組雄性大鼠死亡2只；高劑量組雄性大鼠死亡3只，雌性大鼠死亡1只。

2.2氟化鈉慢性中毒大鼠尿氟、血氟含量變化 實驗結(jié)果顯示，3個月后氟化鈉各劑量組大鼠尿氟、血氟含量顯著高于正常對照組（P<0.01），表明氟化鈉慢性中毒模型建立成功。而且隨著染氟劑量增加，尿氟和血氟含量也增高，具有劑量-反應(yīng)關(guān)系，見表1。

2.3氟化鈉慢性中毒大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶變化 實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，氟化鈉中、高劑量組大鼠BUN、Cr濃度水平顯著升高（P<0.01），表明慢性中毒過程中氟化鈉誘發(fā)大鼠肝臟損傷，見表2。

2.4氟化鈉慢性中毒大鼠腎臟脂質(zhì)過氧化的改變 實驗結(jié)果顯示，給予氟化鈉3個月后，氟化鈉各個劑量組大鼠肝臟中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA具有顯著性增高（P<0.05、P<0.01），且與劑量的增加呈現(xiàn)一定的正比關(guān)系；而SOD和T-AOC隨著氟化鈉劑量的增加而顯著性降低（P<0.05、P<0.01），表明機體抗氧化能力作用減弱。同樣中、高劑量組GSH含量活性顯著下降（P<0.01，P<0.05），見表3。

3 討論

本實驗采用不同濃度的含氟水喂飼大鼠4個月后，氟化鈉各劑量組大鼠尿氟、血氟含量均顯著高于正常對照組，表明已成功地復制出了氟中毒大鼠模型。腎臟在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要的功能。由于肝臟和腎臟特別是腎臟是動物和人體氟排泄的主要器官，也是氟中毒的重要靶器官之一[4]。血清BUN和Cr濃度在一定程度上可反映腎小球濾過率功能的損害程度，是常用的腎功能指標。實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過4個月的喂養(yǎng)后，各組大鼠血清BUN和Cr濃度升高（P<0.01），說明氟化鈉各劑量組大鼠腎功能均受到損傷。

慢性氟中毒是一種全身性疾病，可導致氟在體內(nèi)蓄積，引起氟中毒，過量氟進入機體除了累及牙齒和骨組織外，對非骨相組織和器官亦能產(chǎn)生損害作用[2]。地氟病發(fā)病機理尚未完全闡明清楚，自由基代謝紊亂引起的氧化應(yīng)激性損傷在地氟病的研究中一直是個熱點，發(fā)病機制仍很不清楚。近年來，自由基在疾病發(fā)生中的作用越來越多地受到重視。研究發(fā)現(xiàn)慢性氟中毒與自由基損傷密切相關(guān)，提出自由基損傷是慢性氟中毒發(fā)病機制的中心環(huán)節(jié)[5-7]。 氟作為一種化學性質(zhì)極活潑的元素，在體內(nèi)外均可形成自由基，或者可通過過量的氟干擾機體的正?？寡趸瘷C制，產(chǎn)生過多的氧自由基而損傷膜系統(tǒng)，造成脂質(zhì)過氧化物的增多和清除自由基的酶活性降低[8]。在正常情況下，體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除是平衡的，一旦氧自由基產(chǎn)生過多或抗氧化體系出現(xiàn)故障，體內(nèi)氧自由基代謝就會出現(xiàn)失衡，或稱氧化應(yīng)激[9]。活性氧自由基可以與機體內(nèi)多種生物分子發(fā)生反應(yīng)，破壞正常組織的結(jié)構(gòu)和功能，造成組織細胞生物膜、蛋白質(zhì)、核酸等損傷。

由于脂質(zhì)過氧化可造成組織細胞的嚴重損傷，故機體內(nèi)存在很強的抗氧化系統(tǒng)，包括GSH和VitE等非酶性抗氧化物質(zhì)及SOD和GSH-Px等抗氧化酶系兩部分，外源性毒物可以通過抑制體內(nèi)抗氧化酶系活性或消耗抗氧化物質(zhì)而導致脂質(zhì)過氧化作用增強[10]。體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)能力的降低是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的前提，過氧化肝損傷時機體組織不僅MDA含量可增高，還導致SOD活力下降和GSH含量降低引。MDA是體內(nèi)自由基攻擊脂質(zhì)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物的代謝最終產(chǎn)物，并可對細胞產(chǎn)生進一步破壞作用，MDA不僅是反映脂質(zhì)過氧化的敏感指標，還可間接反映出細胞損傷的程度。而SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，它能清除超氧陰離子自由基保護細胞免受損傷，其活力的高低間接反應(yīng)了機體清除氧自由基的能力。因此，MDA的測定常常與SOD相互配合分析機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化代謝情況。GSH在谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的催化下接受大量電子氧化成二硫化谷胱甘肽（GSSG）的同時減少了過氧化氫及脂質(zhì)過氧化物的形成，因此，GSH可作為評價氧自由基脂質(zhì)過氧化損傷的較敏感的指標[11]。本實驗觀察到慢性氟中毒太鼠腎臟MDA含量增高、SOD活性降低，血清尿素氨含量明顯高于正常對照組，表明腎功能損傷，提示腎功能損傷與SOD活性降低，MDA含量增多有關(guān)，提示慢性氟中毒時腎臟損傷與自由基有密切關(guān)系，這也和文獻報道的相一致[12，13]。此外，實驗中還觀察到GSH和T-AOC含量顯著性降低（P<0.01），提示慢性氟中毒時機體抗氧化能力降低，脂質(zhì)過氧化物的生成。高勤等[7]采用ESR法直接檢測慢性氟中毒大鼠腎組織內(nèi)自由基含量的變化，證實了氟中毒時腎組織內(nèi)自由基增多的事實。

上述事實表明，腎臟的損傷與其中的氟含量有密切的關(guān)系。過多的自由基，攻擊細胞生物膜，引起脂質(zhì)過氧化過程加強，造成腎臟細胞損傷。再次論證，氟中毒時自由基增多誘導的脂質(zhì)過氧化是導致腎臟組織損傷的主要機制之一。本研究結(jié)果為預防和治療地氟病患者提供了科學依據(jù)，但其確切機理還有待于進一步研究。

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編輯/哈濤