利用TAIL—PCR技術(shù)克隆南極磷蝦胰蛋白酶基因

摘要：目的 研究南極磷蝦胰蛋白酶基因的全序列，為低溫酶的基因工程制備建立基礎(chǔ)。方法 以南極磷蝦基因組DNA為模板，利用特異性的巢式引物和隨機(jī)引物，通過交錯(cuò)式熱不對(duì)稱PCR （Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction， TAIL-PCR） 克隆南極磷蝦胰蛋白酶基因序列，并進(jìn)行序列分析。結(jié)果 測(cè)序結(jié)果表明，南極磷蝦胰蛋白酶基因序列全長(zhǎng)961bp，其中含有開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為798bp，編碼266個(gè)氨基酸。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)成功克隆了南極磷蝦胰蛋白酶基因，為進(jìn)一步了解該酶的結(jié)構(gòu)、功能和基因工程制備奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：南極磷蝦；TAIL-PCR；胰蛋白酶；基因

胰蛋白酶是動(dòng)物消化系統(tǒng)中主要的一種堿性蛋白水解酶，屬絲氨酸蛋白酶家族，能專一性地水解肽鏈中賴氨酸和精氨酸的羧基所形成的肽鍵。南極磷蝦因其獨(dú)特的生活環(huán)境，體內(nèi)的胰蛋白酶具低溫高效性，有研究表明，南極磷蝦胰蛋白酶在37℃和1～3℃時(shí)的活性分別是牛胰蛋白酶活性的12倍和60倍[1]。深入研究該酶對(duì)適冷性酶酶學(xué)性質(zhì)的探究、蛋白質(zhì)工程體系的完善具有極高的價(jià)值。目前獲得南極磷蝦胰蛋白酶的方法主要是組織提取，這不僅步驟繁瑣而且成本高昂。本文旨在克隆南極磷蝦胰蛋白酶基因，為進(jìn)一步在工程菌中表達(dá)以大量獲得南極磷蝦低溫酶奠定基礎(chǔ)。

交錯(cuò)式熱不對(duì)稱PCR （Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction， TAIL-PCR）是一種快速有效擴(kuò)增已知DNA序列側(cè)翼未知序列的方法[2-3]，由Liu和Whittier[4]首次報(bào)道該技術(shù)。目前許多基因的克隆都是通過這個(gè)方法獲得，馬春驥等[5]用TAIL-PCR成功克隆了綿羊肺炎支原體Y98株的未知基因Hsp70 （DnaK） ，張偉濤等[6]利用TAIL-PCR克隆了一種耐鹽基因?！?br>