利用TAIL—PCR技術克隆南極磷蝦胰蛋白酶基因

摘要：目的 研究南極磷蝦胰蛋白酶基因的全序列，為低溫酶的基因工程制備建立基礎。方法 以南極磷蝦基因組DNA為模板，利用特異性的巢式引物和隨機引物，通過交錯式熱不對稱PCR （Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction， TAIL-PCR） 克隆南極磷蝦胰蛋白酶基因序列，并進行序列分析。結果 測序結果表明，南極磷蝦胰蛋白酶基因序列全長961bp，其中含有開放閱讀框（ORF）長度為798bp，編碼266個氨基酸。結論 本實驗成功克隆了南極磷蝦胰蛋白酶基因，為進一步了解該酶的結構、功能和基因工程制備奠定了基礎。

關鍵詞：南極磷蝦；TAIL-PCR；胰蛋白酶；基因

胰蛋白酶是動物消化系統中主要的一種堿性蛋白水解酶，屬絲氨酸蛋白酶家族，能專一性地水解肽鏈中賴氨酸和精氨酸的羧基所形成的肽鍵。南極磷蝦因其獨特的生活環境，體內的胰蛋白酶具低溫高效性，有研究表明，南極磷蝦胰蛋白酶在37℃和1～3℃時的活性分別是牛胰蛋白酶活性的12倍和60倍[1]。深入研究該酶對適冷性酶酶學性質的探究、蛋白質工程體系的完善具有極高的價值。目前獲得南極磷蝦胰蛋白酶的方法主要是組織提取，這不僅步驟繁瑣而且成本高昂。本文旨在克隆南極磷蝦胰蛋白酶基因，為進一步在工程菌中表達以大量獲得南極磷蝦低溫酶奠定基礎。

交錯式熱不對稱PCR （Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction， TAIL-PCR）是一種快速有效擴增已知DNA序列側翼未知序列的方法[2-3]，由Liu和Whittier[4]首次報道該技術。目前許多基因的克隆都是通過這個方法獲得，馬春驥等[5]用TAIL-PCR成功克隆了綿羊肺炎支原體Y98株的未知基因Hsp70 （DnaK） ，張偉濤等[6]利用TAIL-PCR克隆了一種耐鹽基因。

1 材料與方法

1.1材料 南極磷蝦冰凍樣本2012年取自南冰洋水域48.1區，限制性核酸內切酶BamHⅠ、EcoRⅤ、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、Genome Walking Kit購自Takala公司，pEASY-Blunt Cloning kit、pEASY-T1 Cloning Kit購自全式金公司，TIANamp Marine Animals DNA Kit購自天根生化科技（北京）有限公司，DNA Engine Dyad PCR儀產自美國Bio-RAD公司，PCR引物由北京華大基因公司合成。

1.2南極磷蝦基因組DNA的提取 南極磷蝦為本課題組參加南極科考任務所取樣品，取其尾節肌肉組織提取DNA，按照動物組織基因組DNA提取試劑盒說明書進行基因組DNA提取。

1.3南極磷蝦胰蛋白酶基因保守片段的克隆 根據文獻及GenBank中已報道同源性較高的幾種甲殼動物胰蛋白酶的氨基酸序列，得到兩條簡并引物。上游引物：CCTTACCAGCTCAGCTTCCAG；下游引物：TGCGGTGTTAGTCATAATCC。使用上述簡并引物對基因組DNA進行PCR擴增，反應體系：template DNA 200ng，primer1 10pmol，primer2 10pmol，PrimeSTAR Max Premix （2X） 25μl，Sterilized distilled water to 50μl。反應條件：98℃ 10s，55℃ 5s，72℃ 5s，35個循環，72℃延伸5min，擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，將PCR產物用QuickGel Extraction Kit回收后克隆至pEASY-Blunt Cloning Vector，經酶切鑒定重組質粒測序。

1.4利用TAIL-PCR獲得基因5' 端序列 根據克隆得到的基因序列，利用Primer5.0軟件設計3條序列特異性的巢式引物，SP1： GAGGAATGGCCTGGA

CGAAGTCATT；SP2：CTCATGTTGGATGATCTTGGACAGG；SP3： AACACAATG

TCCAGCGCAGATGGC。進行TAIL-PCR時，分別用AP1 Primer和AP2 Primer進行反應，以AP2組為例，用上述提取的基因組DNA作為模板，以AP2 Primer作為上游引物，以SP1作為下游引物，進行1st PCR反應。2st PCR 反應將1st PCR反應產物稀釋1000倍，取1μl作為2st PCR 反應的模板，以AP2 Primer為上游引物，以SP2作為下游引物。3st PCR 反應將2st PCR反應產物稀釋1000倍，取1μl作為3st PCR 反應的模板，以AP2 Primer為上游引物，以SP3作為下游引物。三次反應的反應體系和反應條件分別參照Genome Walking Kit試劑盒。反應完成后，取3st PCR反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，將回收產物與pEASY-T1 Cloning 載體連接構建重組質粒，轉化至大腸桿菌Trans1-T1，采用藍白斑篩選，重組質粒經酶切驗證后測序。

1.5克隆南極磷蝦胰蛋白酶基因 利用已獲得的南極磷蝦胰蛋白酶基因5' 端和3' 端序列設計引物，基因組DNA進行PCR擴增，反應體系及反應條件同1.3。擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，將PCR產物用QuickGel Extraction Kit回收后克隆至pEASY-Blunt Cloning Vector，經酶切鑒定重組質粒，測序。

2 結果

2.1 南極磷蝦胰蛋白酶基因5' 端序列 以基因組DNA為模板，利用引物SP1、SP2、SP3與Genome Walking Kit提供的隨機引物AP1、AP2進行三輪PCR擴增，僅用隨機引物AP2得到預期的陽性結果，電泳結果見圖1。將圖1第二泳道長度接近250bp的片段克隆至pEASY-T1 Cloning載體，酶切驗證正確后測序得到一段長為257bp的序列，經分析，確定這257bp含胰蛋白酶5' 端及上游28bp的序列。

2.2南極磷蝦胰蛋白酶基因序列分析 以基因組DNA為模板，利用基因5' 和3' 端引物進行PCR擴增，產物經1%瓊脂糖電泳，電泳結果見圖2。將圖2所得的PCR產物回收后，克隆至pEASY-Blunt Cloning載體，經酶切驗證后，測序，測得其為一961bp的序列，用\"GT-AG法則\"[7]分析發現該片段第267-429位置是內含子，長度為163bp；同時具有兩個完整的外顯子區1-266和430-961。利用DNATools軟件進行分析后，推斷胰蛋白酶含有266個氨基酸。經Clustal X軟件和NCBI Genebank軟件將推測得到的氨基酸序列與已報道的胰蛋白酶氨基酸序列進行比對，發現有較高的相似度。其與凡納濱對蝦胰蛋白酶有較高的相似度（Identities=82%），與日本囊對蝦、中國對蝦的相似度都達到了81%、81%。基因ORF見圖3。

3 討論

胰蛋白酶的研究歷經了粗酶提取、分離純化、分子結構、蛋白亞型研究以及基因的研究[10]，每個階段隨著實驗的推進和分析數據的增加都帶來新理念的更新和研究領域的擴展，現階段甲殼動物胰蛋白酶的研究較少。利用信號肽預測軟件SingnalP推斷南極磷蝦胰蛋白酶的信號肽為1-14aa，前體蛋白為1-29aa。和其它甲殼動物的胰蛋白酶序列一樣，南極磷蝦胰蛋白酶的成熟肽的序列同樣是從Ile-Val-Gly-Gly開始，含有所有絲氨酸蛋白酶中都保守的活性三聯體His74、Asp125、Ser225。

本實驗成功克隆了南極磷蝦胰蛋白酶基因，并合理推斷相應的氨基酸序列，對基因的結構研究、cDNA的獲得及胰蛋白酶層面的探索具有十分積極的意義，本實驗結果為下一步基因表達低溫胰蛋白酶提供了基礎。

參考文獻：

[1] Sjodahl J， Emmer A， et al. Characterization of proteinases from Antarctic krill （Euphausia superba） [J]. Protein Expr Purif， 2002， 26（1）： 153-61.

[2]Singer T， E Burke， et al. High-throughput TAIL-PCR as a tool to identify DNA flanking insertions [J]. Methods Mol Biol， 2003， 236： 241-72.

[3]Huang H， Wang G， et al. Direct and efficient cloning of full-length genes from environmental DNA by RT-qPCR and modified TAIL-PCR [J]. Appl Microbiol Biotechnol， 2010， 87（3）： 1141-1149.

[4]Warshawsky D， L Miller， et al. A rapid genomic walking technique based on ligation-mediated PCR and magnetic separation technology [J]. Biotechniques， 1994， 16（5）： 792-794， 796， 798.

[5]馬春驥，李敏，等. 綿羊肺炎支原體 Y98 株未知基因 Hsp70 （DnaK） 的克隆[J]. 中國獸醫學報，2011， 31（12）： 1733-1737.

[6]張偉濤，程國軍，周俊初. 利用TAIL-PCR克隆耐鹽基因及其分析[J]. 生物技術通報，2010， （11）： 166-170， 176.

[7]吳志強. 太平洋磷蝦 （Euphausia Pacifica Hansen） 胰蛋白酶樣酶酶學性質及基因片段研究[D].青島：中國海洋大學，2007：2-164.

編輯/王敏