燈盞細辛活血化瘀成分篩選

摘要：中藥活性成分的尋找和確定一直是中藥藥理學和中藥化學研究的重點內容。本文根據中藥化學成分與生物大分子發生親和反應產生藥理效應的原理，從數學角度提出尋找活性成分的方法。通過計算親和常數來衡量各化學成分的親和力，親和力較大者為可能的活性成分。隨后以燈盞細辛為例初步說明本方法應用的可行性，并發現8個峰（成分）是作用于血小板可能的成分，其中7號峰被指認為isochlorogenic acid B。本法的應用有望為中藥活性成分的尋找提供新的策略。

關鍵詞：活性成分 親和力 指紋圖譜 HPLC 燈盞細辛

中藥（包括其復方）的作用具有多成分、多靶點、多途徑的特征。針對此特征，\"用'活性成分譜'思路破解中藥的安全性和有效性\"一文[1]相對完整地提出了中藥活性成分譜的思想，也基于親和原理對中藥活性成分譜提出了理論性探索方法。本文試圖從實踐的角度探討此問題的解決方式。由于中藥的有效性是化學成分決定的，因此先從單一化學成分的作用方式進行分析。

1 單一活性成分作用的方式

中藥作用的本質是化學成分與機體生物大分子相互作用的結果，作用的方式是通過親和現象實現的。因此，某一活性分子的作用可以通過類似化學反應的方式來反映，相互作用達到平衡后則有反應式1和公式1。

（D表示游離狀態藥物分子，R表示未被結合的生物大分子，DR表示藥物分子-生物大分子復合物，E表示效應）

KD表示解離常數，此處的單位是摩爾濃度，越小表示對形成復合物越有利。

公式2是分析化學藥物與某一具體生物大分子相互作用產生藥理效應的基礎公式，適用于藥物分子與受體、酶等生物大分子進行的反應，其中KD值越小表示此化學成分與靶分子的親和力越強。實際上，公式2是米-孟方程（Michaelis-Menten Equation）的基礎公式，在此也是我們分析中藥活性成分的基礎公式。

2 中藥化學成分的檢測

先假定提取到的中藥成分都是可能的活性成分，因此中藥提取物的成分可以采用HPLC指紋圖譜的方式來反映，一個峰大體相當于一個化學成分，峰高（或峰面積）的大小則反映該成分的含量（濃度）。

3 理論求解

3.1 必要的假設 由于中藥作用于機體的具體生物大分子尚未完全清楚，在采用公式2進行求解之前，為了簡化問題，特提出必要的假設：①各中藥成分之間無明顯的相互作用；②各成分在與各自的靶分子相互作用時，無明顯的競爭抑制作用；③化學成分與靶分子的親和是雙分子反應，不需要其它分子的介入；④只考慮各成分的直接作用，不考慮其代謝物可能參與的作用。

3.2 絕對求解 為了方便求解，可以將公式2進行變換得公式3和公式4。

公式3就是米-孟方程的雙倒數變換（Lineweaver-Burk變換），而公式4就是Hanes變換。

為了求出[D]和[DR]，可以將不同濃度的中藥提取物與同一可能的靶細胞（組織、器官）勻漿液充分相互作用，然后通過指紋圖譜檢測出[D]（游離藥物）和[DT]（藥物總量），隨后根據公式5求出[DR]。也可以通過特殊方法直接檢測[D]和[DR]。

[DR]=[DT]-[D]（公式5）

當獲得[DR]和[D]后，即可以根據公式3或公式4作圖計算出KD和[RT]。KD和[RT]是兩個重要的常數，其中KD反映某一中藥成分與靶分子間的親和力，越小表示此成分與生物大分子的親和力越強；[RT]是反映可能靶分子多少的參考值，值越大表明可能的靶分子越多。一般來講，KD較小的成分活性較強，值得關注。

在實際工作中，根據公式3和公式4求KD和RT要求至少用2個不同濃度的提取物進行至少2次有效的親和實驗（最好3次以上），這樣求的KD和RT較為可靠。然而絕對求解的前提是必須知道各指紋峰的分子量并能轉化為真實的摩爾濃度。這一點有時很難做到，因此可以進行相對簡化的求解，即KD`和[RT]`。

3.3 相對的簡化求解 必須指出的是，公式3和公式4中的各分子濃度必須使用摩爾濃度，才能求得KD和[RT]的真實值；由于很多指紋峰很難直接指認，在篩選活性成分時更不可能知道其分子量（W）信息和交換因子（f）信息，這時可以用峰高（或峰面積）代入公式3或公式4進行計算，但求得的KD和[RT]會改變，對結果影響分析如下。

游離藥物[D]（摩爾濃度）、藥物總濃度[DT]和結合濃度[DR]與峰面積分子量存在公式6、公式7和公式8關系。

D為藥物的游離濃度，Ai表示某峰親和反應平衡后測得的峰面積，f表示交換因子，W表示分子量

DT為藥物的總濃度，包括游離和結合；AT表示此峰未發生親和測得的峰面積，f和W的意義同公式6

Ai、AT、f和W的意義同公式6～7

將公式8代入[RT]=[R]+[DR]得公式9。

將相應公式6～9代入公式1可以看出，因[RT]改變，KD也在改變。

因此，用峰高或峰面積求得KD實際上是調整后的KD，表示為KD`，相應的[RT]為[RT]`。從以上公式可以看出，調整后的KD`和[RT]`與f和W存在一定的函數關系。

這時KD`和[RT]`對活性成分或某一成分靶組織（細胞）的判斷產生的影響有以下兩種情況：①如果在相同靶組織（細胞）進行親和以判斷活性成分，存在一定的誤差，誤差大小與不同峰的f和W有關。②如果考察某個峰與不同靶組織（細胞）進行親和判斷其最可能的靶組織（細胞），則誤差抵消。

在相對的簡化求解過程中，為了扣除非特異性親和帶來的干擾，消除f和W的影響，可以設立空白親和反應實驗。即將中藥提取物與非特異性蛋白質比如牛血清白蛋白（BSA）等也進行親和反應，也求得相應的KD`和[RT]`。以此為參照，通過計算相對親和力（Ac）和相對RT（RRT）指標，從理論上避免非特異性親和干擾，消除f和W的影響，其計算公式參見公式10和公式11。

AC越小表示親和力越大

RRT越大表示可能的靶分子越多

從公式10和公式11看出，由于采用相對值，因某些中藥化學成分的未知f和W帶來的誤差完全抵消。Ac小于1才有實際意義，且Ac越小表明親和力越大；RRT越大表明可能的靶分子越多。

必須指出的是，Ac和RRT均為無量綱，采用Ac和RRT進行中藥活性成分譜分析時，Ac是要優先考慮的。因為根據前面的假設，親和力是作用的前提。

3.4 關于結合率 親和力反映了化學成分與可能靶分子之間的結合情況，直觀地來看，親和力越大，相結合狀態的化學成分也越多。因此可以根據結合率來簡單反映親和力大小，見公式12。

在公式3和公式4中，[DR]和[D]均是變量，因此公式12求出的結合率也會隨提取物濃度及靶分子量的變化而變化，因此結合率不是常數。

分析如下：

根據公式1，則有公式13；再將公式13進行雙倒數再變換則有公式14。

公式14反映了結合率與[R]存在函數關系。當[R]無窮大時（相當于反應體系藥物濃度無限小），則結合率接近于常數1；而[R]無窮小時（相當于反應體系的藥物濃度無限高），結合率趨向于常數0。

因此，結合率在衡量親和力大小時只具有有限的參考意義，適用于某些特殊情況。比如，當中藥成分的含量較低，游離藥物或結合藥物太少，檢測誤差較大，導致可靠的[D]和[DR]數據不夠時，方可考慮使用結合率來進行活性的粗略判斷。

4 燈盞細辛活血化瘀成分篩選

現以篩選燈盞細辛（Erigeron breviscapus （Vant.） Hand-Mazz）的活血化瘀活性成分譜為例來說明上述方法的應用。由于燈盞細辛注射液的成分較多且其活血化瘀療效也得到了廣大臨床認可，研究也表明燈盞細辛含有不需要生物轉化就能直接起作用的化學成分[5]，故本示例根據親和力篩選燈盞細辛直接的活血化瘀成分。

根據目前的研究成果，活血化瘀的可能靶組織（細胞、分子）主要是血液系統，包括血液、紅細胞、血小板、血漿成分等。因此將此中藥成分提取后（采用燈盞細辛注射液，云南生物谷燈盞花藥業有限公司，批號20090830）與兔血的全血、紅細胞、血漿、血清、血小板進行親和反應（以BSA為對照）。進行親和反應時，固定生物樣品的量，用梯度濃度的提取物與生物樣品進行相互作用（4℃過夜），記錄反應前的HPLC-UV指紋圖譜（其峰面積相當于[DT]）。燈盞細辛注射液的指紋圖譜參見圖1，在當前條件下，各指紋峰的檢測重復性較好（RSD<8%，n = 5）。反應后，將體系用超濾法去蛋白操作再獲得去蛋白液的HPLC-UV指紋圖譜（其峰面積相當于[D]）。[7]求出[DR]后，可以根據公式3可以計算出各峰的常數KD（KD`）和[RT]（[RT]`），并根據公式10和公式11求出相對親和常數（Ac）和相對RT（RRT），結果分別見表1和表2。

A：燈盞細辛注射液指紋圖譜；B：四個對照品的指紋圖譜（均購自中國藥品生物制品檢定所）色譜條件（液相色譜儀：日本島津公司 島津LC-2010C；檢測波長：330nm；柱溫：35℃；色譜柱：Phenomenex luna 5μ C18；洗脫梯度：10% A （0 min），17.5% A （20 min），17.5% A （40 min），45% A （80 min） and 45% A （90 min），A=乙腈，B=1%甲酸）[8]

No.3為綠原酸（chlorogenic acid），No. 5為咖啡酸（caffeic acid），No. 7為isochlorogenic acid B，No. 10為燈盞乙素（scutellarin）。

表1結果表明，指紋峰中（見圖1）的16個成分尚有部分Ac在當前條件下未能測出，但能夠大體看出，燈盞細辛提取物對紅細胞的相對親和力均較小，而對血小板的親和力較大。對四個已知化合物而言，No.7 （isochorogenic acid B）和No.3和對全血、血漿、血清和血小板用的Ac值均較小，提示此成分與血小板有較強的親和力，可能具有較強的抗血小板活性。對照表2，No.7的血小板RRT較大，提示其作用靶點可能主要分布在血小板。實際上目前的文獻也表明No.3[9， 10]和No.7具有較好的抗血小板活性[11]。No.10（燈盞乙素）具有較強的活血化瘀活性[12]，但在燈盞細辛注射液中含量較低，本研究仍未能計算其Ac值。而其No.3（caffeic acid）的血小板活性較弱，只有在較大劑量才顯示出抗血小板活性。本研究計算的Ac和血小板活性大致相符。因此，根據表1和表2結果，本次篩選結果提示血小板是燈盞細辛活血化瘀作用的主要靶細胞，并篩選出8個峰是作用于血小板可能的成分，其中7號峰被指認為isochlorogenic acid B。

5 問題與展望

5.1 理論性問題 本文前述的4項假設與實際情況具有一定差距。中藥化學成分較多，且很多化合物具有相似結構和相似的化學性質，這可能會在一定程度上干擾其它化學成分與靶分子的親和。

另外，親和力只是中藥化學成分發揮藥效的前提條件，親和力參數KD、KD`及Ac均沒有包含活性方向信息（比如對生物大分子的激活或抑制作用）。因此某個高親和力化學成分是否最終具有藥理活性還必須結合傳統藥理學模型進行生物活性驗證。

5.2 技術性問題 從示例可以看出，本方法要求指紋圖譜檢測方法有較高的靈敏性和穩定性。由于條件限制，本示例采用的是HPLC-UV分析方法，靈敏度有限，導致許多Ac和RRT均未能求出。事實上，采用高靈敏度檢測方法比如HPLC-MASS，圖1中可辨認的指紋峰可達50多個[8]。除UV檢測器外，盡管本實驗檢測條件與參考文獻[8]相同或接近，卻只能測出其中的16個峰。其次，在去除生物大分子的操作中，大分子是相對概念，徹底去除是相對的，因此在檢測中可能還會帶來干擾。

5.3 展望 采用親和原理和指紋圖譜技術來獲取中藥化學成分的活性信息是一個有益的嘗試。這將為中藥活性成分的研究提供新的思路，有望為指紋圖譜和生物活性建立起有效的內在聯系。

參考文獻：

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[3]段為鋼. 中藥有效成分譜篩選方法 [P]. 中國： CN 101013111A， 2007-08-08.

[4]Zhang Y.， Shi P.， Qu H.， et al. Characterization of phenolic compounds in Erigeron breviscapus by liquid chromatography coupled to electrospray ionization mass spectrometry [J]. Rapid Commun Mass Spectrom， 2007， 21（18）： 2971-2984.

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[7]Chang W.C.， Hsu F.L. Inhibition of platelet activation and endothelial cell injury by polyphenolic compounds isolated from Lonicera japonica Thunb [J]. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids， 1992， 45（4）： 307-312.

[8]陳鵬， 王殿華， 雷偉亞， et al. 燈盞乙素對血栓形成及血小板聚集的影響 [J]. 昆明醫學院學報， 2006， 27（4）： 1-5.

編輯/王海靜