粘附NK細胞：全球治療試驗縱橫

摘要：過繼免疫治療是當前醫學研究的重點內容，在細胞免疫中，A-NK細胞作為腫瘤過繼免疫治療（AIT）中的一種新型免疫效應細胞，具有短期內大量增殖，調節機體免疫能力，抗菌，抗病毒，抗衰老，抗腫瘤的特點受到普遍關注，臨床應用也顯示出廣闊前景。本文追蹤國際上研究進展就有關A-NK細胞生物學特性，免疫調節及臨床應用的研究現況及進展作以簡要綜述。

關鍵詞：過繼免疫治療；A-NK；臨床應用

中圖分類號：R473.73 文獻標示碼：A

近年來，隨著人類疾病治療學的進展，過繼免疫治療（AIT）成為免疫生物治療中的主要療法之一。從80年代后期，LAK、TIL、NK、CTL、DC、CIK等效應細胞陸續被發現，國內外的基礎和臨床應用報道層出不窮。1988年美國Pittsburgh大學首次從LAK細胞群體中分離純化了一種具有高效殺傷活性的LAK亞群，由于它具有粘附在塑料表面的特征將其命名為A-LAK（ad herent LAK）。之后， 隨著A-LAK研究的深入和進展，我們發現其與LAK之間有著諸多不同之處， 而與NK細胞具有相同的表面標志，相似的生物學活性，本課題組近年多以A-NK（activated NKcells）代替A-LAK這個名稱。

1 A-NK的生物學特征

A-NK可來源于人外周寫單個核細胞（PBMNC）、骨髓、淋巴結、脾細胞、臍帶血等，其中后兩者是最好的A-NK來源。美國Pittsburgh大學Vujanovic課題組最初分離制備A-NK時提出，A-NK可能來源于大淋巴細胞，因為在形態、表型特征和生物學活性方面，二者具有同源性[1]。1990年Melder通過A-NK形態及超微結構研究指出，初次分離的A-NK在粘附相及非粘附相之間周期性波動。動態觀察有無IL-2條件下常規NK的粘附狀態表明，只有相當少的一部分NK（1%～10%）具有自發粘附到塑料表面的特性，但在6000IU/mlIL-2存在時，一部分（4%～30%）NK也可以迅速轉化為粘附NK，24h后這部分細胞又失去粘附活性。因此，IL-2誘導NK粘附作用只是非常迅速的一個過程。A-NK的超微結構與高度活化的NK一致，所有的A-NK均為球形，表面有眾多絨毛和偽足。在粘附相，A-NK也是可動的，一般可沿著固體表面移動1μm/min，1個極性末端是有皺而毛糙的邊角結構，另一端絨毛呈線圈樣。用透射電鏡也證實A-NK結構高度極化，一端為細胞核，另一端為細胞漿，顆粒豐富，骨架結構較大，具有多囊泡小體和活躍的Golgi小體[2]。此后研究進一步明確，A-NK來源于成熟靜息狀態的NK亞群，占全部單個核細胞的1%～4%，占總NK的15%～50%，與未成熟NK或活化的終末NK細胞不同。A-NK代表了表型和功能獨特的NK亞群。用流式細胞儀（FACS）進行A-NK表面標志分析顯示，A-NK表達CD56dim -CD16dim -β2 intergrinsbrightIL-2Rp75+表型，A-NK和NK一樣，其表面有多種復雜的粘附分子（CAM）存在，并與其生物學活性息息相關。為了評價CAM在A-NK粘附特性中起的作用大小，Melder發現CD11c，CD11a，CD18分子在活化的NK與內皮細胞相互作用中起關鍵作用，與A-NK粘附于腫瘤血管而短暫停留于正常組織的現象有關。也有學者證實CD18相關的層粘連素CD11a，CD11b，CD11c，CD2在A-NK與靶細胞的相互識別中起重要作用。Gunji Y指出A-NK是大顆粒淋巴細胞，表達NK細胞表型膜標志（asialo GM1+， NK1.1+， Qa5+， Ly-6.2+， Thy-1.2+，但Lyt-2.2 and L3T4陰性），具有相對較高的細胞毒性[3]。圖1為本課題組提取活化的A-NK免疫效應細胞，它通過突觸粘附至癌細胞（掃描電鏡）。圖2顯示A-NK細胞聚集，粘附至癌細胞周圍，形成花環狀，腫瘤細胞呈現空泡變性，細胞膜損傷、溶解等壞死征象（透射電鏡）。

2 A-NK的腫瘤治療研究

2.1 A-NK體外增殖能力和抗腫瘤能力 A-NK優點主要有2點：①是抗腫瘤能力強；②是體外擴增能力強。在自體條件培養基（AuCM）存在條件下，A-NK可于20d內擴增130～1100倍，臨床級A-NK擴增倍數稍低，但也可于8～14d內擴增10～22倍。以22nmol/mlIL-2誘導下是否能迅速粘附到實體表面的能力，NK被分為兩種不同亞群，A-NK和NA-NK[2]。分別培養二者作動態比較，A-NK增殖能力始終強于NA-NK，但誘導力遲于NA-NK。在抗瘤能力方面，A-NK結合并殺傷K562和Daudi細胞的能力明顯高于NA-NK，并能侵潤到腫瘤細胞囊球內部殺傷腫瘤細胞。大量體外實驗表明，A-NK抗NK敏感性K562，NK抵抗性Daudi、Raji及新鮮腎細胞癌、子宮頸癌、卵巢癌的能力遠強于常規LAK。體內實驗也證明，A-NK和IL-2過繼輸注幾乎能完全抑制在裸鼠體內建立的人頭頸部鱗癌模型腫瘤的生長，對胃癌肝轉移模型能明顯減少肝內轉移瘤數目并延長小鼠生存期[3]。A-NK/IL-2療法對實體瘤的治療結果很大程度上取決于A-NK在腫瘤部位的聚集能力。這種選擇性聚集能力至少受五種因素影響：①腫瘤血管的構造和超微結構；②A-NK的不規則外形；③IL-2激活的A-NK剛性增強；④A-NK表面高度表達的CAM與機體血管及腫瘤微循環的相互作用；⑤腫瘤組織可能分泌一些趨化性介質，如TGFβ，IL 6等，吸引和促進A-NK聚集和粘附。實驗發現靜脈注射的A-NK很快就在肺臟和肺部轉移灶聚集和停滯，只有相當少的一部分A-NK隨后進入循環。到達肺部轉移灶的A-NK一部分來源于血液，另一部分從周圍的肺組織移行過來。而到達腫瘤特定部位的A-NK細胞數量多少是關系到療效好壞的關鍵步驟。自從1991年日本Basse P提出局部輸入A-NK可以更好地使其聚集在已建立的荷瘤鼠模型的肝癌或肺癌部位之后，A-NK的研究者們意識到其體內存活及分布情況與輸入途徑及IL-2劑量密切相關。Sacchi使用腫瘤局部注射A-NK和IL-2在建立的人頭頸部鱗癌鼠模型中獲得了良好療效，并顯著減少了全身治療的副作用。1998年Heganaars使用熒光標記A-NK，在小鼠肝癌模型上比較了三種輸注途徑（通過肝動脈、門靜脈和頸靜脈給藥）A-NK的選擇性聚集情況，結果發現肝動脈途徑A-NK在腫瘤部位聚集最多，其次是門靜脈，而頸靜脈途徑最少。這說明局部注射A-NK比靜脈給藥的全身治療具有更確切的效果和更大的潛力，A-NK的局部應用成為研究者們關注和提倡的給藥途徑[4-8]。

2.2 A-NK抗腫瘤作用機制 A-NK作用機制還沒有明確結論，可能存在多種機制：①與NK相似的穿孔素和顆粒酶介導的腫瘤溶解作用；②直接接觸腫瘤細胞發揮殺傷作用。Felgar1992年提出，A-NK存在一種漿膜相關溶解因子（M-CTX），通過使DNA斷裂和胞膜大面積腫脹使靶細胞致死；③A-NK可以分泌多種細胞因子，如IL-2，IL-4，IL-10，IFNγ，TNFα等，可以破壞腫瘤微循環，激活機體免疫系統，也有人認為細胞因子介導腫瘤DNA斷裂，引起腫瘤細胞緩慢凋亡。BlomWM觀察到在殺傷過程中，靶細胞出現線粒體膜電位下降，大皰結構形成，磷脂酰絲氨酸外表達，染色質聚集和核碎裂的現象，一旦凋亡被阻止，只表現出相當有限的靶細胞壞死效應；④在A-NK和細胞因子刺激下，內源性其它的效應細胞（主要是中性粒和T細胞）和細胞毒分子滲出，引起腫瘤出血壞死[9]。德克薩斯大學研究表明CD16+， CD56+， CD3- NK 發揮最大的細胞毒功能，CD5+ 細胞亞群也參與其中[7]，A- NK也 提供了一種新的白血病治療手段。

德國Koberda J表明， A-LAK 的一個特征是IL-2和該細胞表面p55 IL-2受體結合導致內源性細胞因子的釋放，如IFNr，TNFa，IL-6，由此使之具有最好的細胞毒性[10]。Sasaki A，觀察到注入的A-NK細胞在1～2d內可進入腫瘤的微血管，隨后彌散到腫瘤周圍引起腫瘤細胞壞死的發生，提示過繼免疫療法直接的細胞毒性是經由腫瘤血管介導的，這一點作為腫瘤治療的一個機制必須加以重視[11]。另有意大利研究者Ruffini PA在一個類似試驗中證實粘附的要比非粘附的A-NK作用明顯，但同時指出轉化因子中和抗體（TGF ）可以影響局部細胞免疫治療的有效性[12]。Felgar RE報告該課題組從高度純化的A-NK細胞漿膜中發現并純化了一個新的細胞溶解因子plasma membrane-associated cytolytic factor （designate命名為 M-CTX），這種因子是以前未曾描述過的膜相關毒素，可能參與接觸介導的細胞殺傷[13]。

可以看出，A-NK的殺傷腫瘤細胞的機制涉及細胞之間，細胞因子之間乃至與免疫系統之間的相互作用，是一個復雜的過程。

3 A-NK的協同效應和調節因素

越來越多的學者開始探索免疫調節劑對A-NK的輔助作用。GuS發現腫瘤局部注射弗氏佐劑（Freund'scompletead juvant）能有效促進A-NK的選擇性聚集，延緩腫瘤生長[14]。在動物實驗中，WhitesideTL等以環磷酰胺（Cyclophos phamide）和苯丙噻嗪（Benzothiazoles）與A-NK/ IL-2聯合作用，都取得了明顯的協同抗瘤效應[15]。英國學者Gold farb以A-NK做載體，在不影響效應細胞變形性和細胞活性前提下連接免疫抑制劑阿霉素（Doxorubicin），表現出對靶細胞獨特的化學治療作用，而且避免了化療帶來的不必要的全身性副作用，證實了這一方法的可行性，Goldfarb常規分離制備A-NK是用尼龍毛法去除單核巨噬細胞，避免其對A-NK的增殖和細胞毒的抑制作用[16]。有文獻表明苯丙氨酸甲酯（PME）可有效去除單核巨噬細胞而不改變淋巴細胞的表型和細胞毒性，是一種簡便快速的制備方法。Trozzi采用此法獲得的腎癌患者A-NK的增殖活性和殺傷能力都有所增強。在肝癌患者A-NK制備上鄭寧等也取得了類似效果。并且提出，苯乙酸（PA）是苯丙氨酸在人體內的自然代謝產物之一，它對于腦瘤、前列腺癌、肺癌、腎癌等多種腫瘤都具有抑制腫瘤細胞生長，促進腫瘤細胞誘導分化的作用。經苯乙酸預處理的腫瘤細胞上清液對A-NK增殖和殺傷活性的抑制作用明顯減弱，表明苯乙酸可以減少腫瘤細胞產生的免疫抑制因子，拮抗腫瘤對于生物治療療效的抑制，從而發揮協同抗瘤作用[17]。

德國的Moller P應用IL-2， IL-7活化A-NK細胞，發現兩者都可單獨刺激A-NK擴增，但IL-7的效果較差，兩者結合可誘發更好的擴增和殺傷效果，同時對惡性黑色素有一個選擇性的殺傷，而對非惡性角化細胞株和正常纖維母細胞則無此作用[18]。但Sedlmayr P報道盡管有IL-2和其它生長因子存在的情況下在進展性惡性黑色素瘤和腎癌患者單個核細胞中誘導的CD3-CD56+細胞和正常獻血者比較，不論是誘導的數量還是A-NK細胞的殺傷活性都較正常獻血者誘導的A-NK偏低[19]。我們的研究證實用IL-4/IL-2或IL-12/IL-2聯合應用可獲得更理想的誘導活性[20-22]。

4 A-NK的臨床應用

A-NK最早應用于臨床是1988年，Melder用A-NK/IL-2療法治療腎癌和黑色素瘤患者，結果發現對LAK/IL-2療法有效的腫瘤對A-NK/IL-2療法也有效[23]。但A-NK的生物學特性和體內分布情況已表明，這種細胞容易附壁，在血管中運行不良，所以臨床上不宜全身給藥，局部治療是理想的途徑。1990年意大利Mu nari[24]采用PBL源性A-NK/IL-2治療惡性膠質瘤，初步證實了腫瘤原發部位直接注射效應細胞是行之有效的方法。1994年Boiardi等應用此法治療9例膠質瘤術后患者，通過手術時放置的\"Ommayatube\"將A-NK/IL-2直接注入手術殘腔內。結果有效率為33%（1例完全治愈、2例部分治愈、4例進入穩定期、2例病情進展）。分析原因Boiardi提出：①雖然治療過程中檢測了腦脊液中IL-2濃度（達1800～3600IU ml）在體外足夠維持效應細胞增殖和細胞毒作用，但手術殘腔內的壞死灶分泌的TGFβ或PGE2可能限制效應細胞的殺傷功能：②雖然所有患者腫瘤都復發了，但其與常規療法有所區別的是，常規治療后90%以上腫瘤復發部位是在距原發灶3cm之內，而A-NK治療后的復發部位的60%都發生在距導管邊緣（thecathetertip）2cm之外；③由于放療作用導致了原發灶周圍組織纖維化，阻止了效應細胞的滲透和作用的發揮。但腔內注射法對晚期患者和失去手術機會的腫瘤來說意義不大。除了給藥途徑，臨床上如何獲得足夠質和量的PBMNC源性A-NK，也是治療能否成功的關鍵。腫瘤患者接受大劑量放療和化療后，使獲得足夠量優質的A-NK帶來一定困難，而進展期腫瘤患者的A-NK的質量往往不及病情穩定期患者及正常人。在血液病患者中這種情況較為明顯[25]。Verfaillie和Lotz oua等學者分別報道過慢性髓細胞性白血患者在病情進展期分離得到的A-NK的體外增殖能力和細胞毒性均比慢性期患者低，而緩解期非淋巴細胞白血病可以分離培養出較高抗癌活性的A-NK細胞。對于實體瘤患者，這種現象相對較少[26]。Schwarz等學者對33例肝腫瘤患者進行了實驗，比較其中6例良性腫瘤，10例原發肝癌和17例轉移性肝癌A-NK擴增能力與良性腫瘤患者一致，均可以達到較高水平[27]。我們在臨床治療中采用胎兒臍帶血細胞作為A-NK來源，實踐證明可獲得足夠數量的A-NK細胞用來滿足臨床的治療需要。我們用A-NK細胞對人直腸癌CC95裸鼠移植癌進行治療取得了較為滿意的結果[28，29]。

Basse PH研究了粘附的和非粘附的A-NK通過不同途徑對治療效果的影響，將上述兩種細胞用125IUdR進行標記，調查它們在血液循環中和腫瘤局部及組織中的分布情況。發現靜脈注射的A-NK細胞絕大部分分布在肺臟，只有不到15%到達其它器官；在左心室注射后較多的A-NK分布到肝，腎和內臟，24h后各個器官的A-NK所剩不多；經門靜脈注射的細胞在肝臟累積的A-NK較多，24h后仍然有40%以上A-NK細胞在肝臟停留，結果提示如果想增加細胞在特定器官的蓄積量，那么應該直接輸入該器官的營養血管為宜，這樣才能達到較好的蓄積和治療效果[30]。Basse PH還應用鐵蛋白預先標記A-NK細胞用熒光顯微鏡觀察，證實輸注的A-NK細胞能夠對遠離腫瘤病灶，血管外的轉移性黑色素瘤細胞緊密接觸，從而發揮抗轉移作用[31]。

Basse P用瑩光染料標記A-NK細胞在動物實驗中研究它們在各個器官累計和分布以及代謝情況獲得的獲得的實驗數據與此類似。

縱觀全球，NK細胞（含A-NK）仍主要限于基礎實驗研究，國外的臨床試驗開展的并不廣泛[32-34]，主要集中于美國，歐洲和日本。國內除我們外尚無先例性報道，從我們治療的情況來看治療是安全的，實驗室方面嚴格管理，層層把關，護理方面審慎操作，一絲不茍，至今尚未發現嚴重的發熱和過敏等毒、副反應發生[35，36]，本課題組申報的A-NK細胞臨床治療已經被黑龍江省衛生廳和物價局列為正式新型治療手段批準在臨床應用[37]。我們期待會有一個更好的臨床療效面世，以饗讀者，同時回饋廣大患者群體的殷切希望。

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編輯/哈濤