眼針療法干預MCAO模型大鼠抗氧化機制的研究

隨著人口老齡化的加重，中風病發病率也隨之提高，嚴重威脅著人類健康，探索中風病發病機制及有效防治方法成為醫療工作者的首要任務。眼針是以祖國醫學臟腑經絡理論為基礎，根據眼球結膜上血管的形色變化，判斷性質和部位，然后辨證針刺眼周特定穴位以治療全身疾病。根據后天八卦將眼周分為八個區，再與五臟六腑聯系起來，治療急性缺血性中風時選取肝區、腎區、上焦區、下焦區以滋腎陰，清肝火，輸通上下焦氣機，活血通絡，使病得愈。

眼針對于缺血性中風的療效已為眾人所承認，但其作用機制尚不清楚，本研究擬采用動物實驗的方式，探索眼針對缺血性腦病的抗氧化作用機制。

1實驗材料

1.1實驗動物 SPF級SD大鼠60只，購自中國醫科大學，許可證號：SCXK（遼）2008-0005。大鼠購入后適應性飼養1w，1w后用于正式試驗。大鼠飼養于通風干燥的環境中，室溫（18±2）℃，相對濕度45%。常規顆粒飼料喂養，自由飲水，12h晝夜節律，更換1次/d墊料，以保證大鼠生存環境潔凈。

大鼠體重均勻，均在（300±30）g范圍，毛色純白，富有光澤，活動度適中，晚間活動度增加，步態正常，行為學觀察未見異常大鼠。

1.2儀器設備 恒溫水浴振蕩器，SHA-B型，常州國華儀器設備廠生產。電子天平，JY5002型，0.01g～500g，上海精密科學儀器有限公司生產。電子天平，BS223S型，0.001g～220g，北京賽多利斯儀器系統有統公司生產。微量移液器，美國熱電公司生產。紫外分光光度計，T6新世紀型，北京普析通用儀器設備有限公司生產。

1.3實驗試劑及耗材 MDA、SOD和GSH-PX測試盒購自南京建成生物研究所。針灸針購自成大方圓連鎖藥店（陵東分店）。凍存管、吸頭、PCR管等耗材均購自沈陽博爾美生物有限公司。

2實驗方法

2.1實驗動物模型的復制

2.1.1腦缺血再灌注大鼠模型的復制 參考馬賢德[1]等人發表的\"線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的方法研究\"一文復制腦缺血再灌注大鼠模型。模型復制成功后，栓塞2h后，拔除栓塞線，進行再灌注，再灌注時間為72h。

2.1.2假手術組動物模型復制 假手術組手術方式同模型組，但不做栓塞，僅暴露出右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內動脈（ICA），然后逐層縫合即可。

2.2模型評價 神經功能缺損評分：參考Longa及Bederson的5分制法在動物麻醉完全清醒后進行評分[2]。0分：沒有神經損傷；1分：對側前爪不能自由伸展；2分：向對側旋轉；3分：向對側翻到；4分：行走不自由，意識模糊。分值越高，說明動物所表現出的問題就越多。選取評分在1～3分的動物模型進行試驗。

2.3實驗分組及干預因素施加

2.3.1實驗分組 SPF級SD大白鼠60只，隨機分為四組：空白對照組（10只），假手術組（10只），MCAO模型對照組（20只），眼針治療組（20只）。

2.3.2各組干預因素施加 空白對照組，常規飼養，不施加任何干預。假手術組，采用2.1.2中所述方法，復制假手術模型，模型復制后正常飼養，不做任何處理，模型復制后72h進行相關指標檢測。MCAO模型對照組，采用2.1.1中所述方法，復制腦缺血再灌注模型，模型復制后，正常飼養，不做任何處理，于再灌注72h進行相關指標檢測。眼針治療組，采用2.1.1中所述方法，進行MCAO模型復制，再灌注即刻開始進行針刺治療，2次/d，連續3d。于再灌注72h進行相關指標檢測。

2.3.3眼針取穴及刺法 取13mm毫針，眼針組選定大鼠眶周2mm處進行針刺，選擇的位置比對人體取穴措施[3，4]，選取肝區、上焦區、下焦區、腎區，見圖1。采用針刺的手段：從眼眶邊緣2mm部位進行平刺，左眼從順時針方向（右側按逆時針方向），從該穴區起始定位線向終止定位線進針，進行平刺操作，刺入真皮，達到皮下組織，進針3mm，到終止定位線為止。留針20min，留針10min時用刮柄進行刮針1次，刮針5下。

圖1 眼針定位示意圖

2.4指標檢測

2.4.1死亡率和神經功能缺損評分觀測 各組大鼠模型復制成功后，進行再灌注前參考\"神經功能缺損評分\"標準進行行為學評分，以評價模型復制成功情況。末次針灸后，清點各組大鼠數量，計算總死亡率，并對各組大鼠再次進行神經功能缺損評分，統計分析組間差異。

2.4.2 各組大鼠血清中MDA、SOD和GSH-PX含量測定 各組大鼠末次針灸后，以10%水合氯醛（3.5ml/kg體重）腹腔麻醉，剖開腹部，經腹主動脈采血，靜置1h后，2000轉/min，離心10min，分離血清備用。

采用比色法對各組大鼠血清中MDA、SOD、GSH-PX的含量進行測定。

2.5統計方法 采用SPSS11.5統計軟件分析，實驗數據均采用\"x±s \"表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05被認為有顯著性差異。

3結果

3.1死亡率和神經功能缺損評分結果 空白對照組大鼠10只，除隨機抽取1只，處死進行TTC染色外，無死亡大鼠，死亡率為0；假手術組大鼠10只，除隨機抽取1只，處死進行TTC染色外，無死亡大鼠，死亡率為0；MCAO模型對照組大鼠20只，除隨機抽取1只進行TTC染色，以及模型復制失敗大鼠2只，剩余18只，至實驗結束后，共計死亡7只，剩余11只，死亡率為38.9%；眼針治療組大鼠20只，除隨機抽取1只進行TTC染色，以及模型復制失敗大鼠2只，剩余17只，至實驗結束后，共計死亡4只，剩余13只，死亡率為23.5%，見表1。

空白對照組和假手術組大鼠末次針灸后，神經功能缺損評分均為0分，未見明顯神經功能缺損體征。MCAO模型對照組大鼠神經功能缺損體征較為顯著，其評分與其他三組比較，均有顯著性差異（P<0.01），見表2。

3.2各組大鼠血清MDA、SOD和GSH-PX含量 各組大鼠血清中MDA含量檢測結果表明，與空白對照組和假手術組比較，其余兩組大鼠血清中MDA含量均顯著升高（P<0.01），有統計學意義；與MCAO模型對照組比較，眼針治療組大鼠血清中MDA含量顯著減少（P<0.01），有統計學意義。

各組大鼠血清中SOD和GSH-PX含量檢測結果表明，與空白對照組和假手術組比較，其余兩組大鼠血清中SOD、GSH-PX含量顯著減少（P<0.01），有統計學意義；與MCAO模型對照組比較，眼針治療組大鼠血清中SOD、GSH-PX含量顯著增加（P<0.01），有統計學意義，見表3。

4討論

自由基可使細胞中的蛋白質、核酸等大分子物質發生交聯反應，有損生物膜， 細胞的功能也將受到影響。抗氧化系統存在于機體內，能夠相互排除自由基，使脂質過氧化物的生成減少，為了自由基在人體內生成，以及人體內自由基的清除處于動態平衡。需借助于如谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT） 等抗氧化酶，但在缺血再灌注條件下，機體會產生大量的自由基，使其生成與清除平衡失控，造成組織的損傷。通過氧化反應造成細胞膜磷脂分子中的不飽和脂肪酸的過氧化是自由基， 導致磷脂結構產生變異，膜遭受一定程度的創傷，這樣導致神經細胞功能受到連鎖反應的是生成的脂質過氧化物經過氧化酶催化生成MDA。清除機體自由基的主要類是 超氧化物歧化酶（SOD）， 間接反映腦組織并且消除自由基的功能是靠SOD活性高低程度；腦組織中氧自由基含量的變化，及脂質過氧化程度和腦細胞損傷程度由丙二醛（MDA）是脂質代謝產物，其含量間接反映。機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶為谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）。GSH-Px酶系的組成成分是硒，催化GSH變為GSSG，是GSH-Px酶系的生成部分，它的作用能使有毒的過氧化物變成無毒的羥基化合物，而且還可以讓H2O2得到有效的分解，以此維護細胞膜的組織及能力免遭過氧化物的影響。硒半胱氨酸為GSH-Px的活性中心，反映機體硒水平靠其活力大小。催化GSH產生GSSG是谷胱甘肽過氧化物酶，而谷胱甘肽還原酶可以利用NADPH催化GSSG產生GSH，計算出谷胱甘肽過氧化物酶的活力水平通過檢測NADPH的減少量即可。在上述反應中，整個反應體系的限速步驟是谷胱甘肽過氧化物酶，因此NADPH的減少量和谷胱甘肽過氧化物酶的活力線性有著十分密切的關系。

研究結果表明MCAO模型組大鼠血清中SOD、GSH-PX含量較正常組明顯降低，同時MDA含量較正常組明顯升高，此時大鼠亦出現神經功能缺損癥狀；經眼針療法防治后腦缺血再灌注大鼠血清中SOD、GSH-PX含量呈現升高，同時MDA含量比模型組降低，大鼠的神經功能缺損程度也減輕。結合以往的研究結果，腦缺血再灌注后，機體內自由基的生成增加，使SOD、GSH-PX的含量降低，同時脂質代謝產物MDA的量增多；由此腦組織的受損嚴重，大鼠表現出提尾時左側前肢難以伸直的形態， 行走是出現向對側旋轉，有時身體發生傾斜、最終倒下的狀況。針對這種癥狀采取針刺療法進行防治后，可采取腦缺血再一次注射到大鼠血清中SOD、GSH-PX的含量的措施，以次讓多余的自由基得到清除，減少產生的脂質代謝產物MDA， 大鼠神經功能缺損的癥狀得到了減輕。

綜上所述，我們認為\"眼針療法\"可有效抑制機體內自由基氧化作用的相關途徑，從而發揮其抗腦缺血再灌注損傷的腦保護作用。

參考文獻：

[1]馬賢德，孫宏偉，柴繼嚴，等.線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的方法研究[J]，中華中醫藥學刊，2009，27（6）：1200-1201.

[2]Zea Longa E， Weinsten PR， Carlson S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20：84-91.

[3]彭靜山.眼針療法[M].沈陽：遼寧科學技術出版社，1990，11.

[4]田維柱.中華眼針[M].沈陽：遼寧科學技術出版社，1998：78-88.編輯/申磊