熏煙和氣道內滴入脂多糖建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型

摘要：目的 評價熏煙和氣道內滴入脂多糖（LPS）建立大鼠慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型的可行性。方法 40只SD大鼠隨機分為正常對照組和COPD模型組，模型組熏煙和氣道內滴入LPS16w。測定氣道阻力，計數大鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白細胞總數，肺組織病理切片行HE和AB-PAS染色，并測定肺組織粘蛋白（MUC5AC）含量。結果 模型組大鼠氣道阻力增加（RL%）較對照組有顯著性差異，BALF中白細胞總數明顯高于對照組，光鏡下可見病變呈慢性支氣管炎，肺組織MUC5AC含量明顯高于對照組。結論 熏煙和氣道內滴入LPS能建立較符合人類COPD病變的大鼠模型，為進一步的研究提供參照資料。

關鍵詞：肺疾病；慢性阻塞；脂多糖；吸煙；大鼠

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常見的呼吸道疾病，目前發病率和病死率都較高，社會經濟負擔重，但其發病機制尚不明確，影響了該病藥物的研發。鑒于吸煙和反復不斷的氣道感染是COPD發生發展的主要原因，我們采用熏煙和氣道內滴入LPS的方法建立COPD的大鼠模型，為進一步研究人類COPD提供參照資料。

1資料與方法

1.1試劑與動物 脂多糖（LPS，EsherichiacoliO111：B4，美國Sigma公司）；乙酰甲膽堿（Mch，美國Sigma公司）；MUC5AC（粘蛋白）ELISA試劑盒（武漢優爾生科技有限公司）。健康雄性SD大鼠，體重（200±20）g，由浙江省實驗動物中心提供。

1.2造模方法 SD大鼠40只，隨機分為正常對照組和COPD模型組。將模型組大鼠分批置于自制有機玻璃密閉熏煙箱（85 cm×85 cm×45 cm）內，每天（一周6d，滴LPS當天除外）共煙熏40 min，分2次進行，1次給予12支Marlboro香煙，持續20min，間隔10min再熏煙1次，每批總共給予24支香煙。氣道內滴入LPS的時間為每隔2w 1次，除對照組外，其余大鼠氣管內用靜脈套管針滴入200μg脂多糖（用生理鹽水配制成1 g·L-1溶液），對照組氣道內滴入等量生理鹽水（NS），每隔2w 1次至第16w結束。

1.3大鼠氣道阻力（RL）測定[1] 第16w后用30%烏拉坦（3.3 ml·kg-1，ip）麻醉大鼠，用Medlab生物信號采集處理系統記錄儀，導出基礎潮氣量（VT）和氣道流速（V），計算RL。配制濃度為0.125、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg·mL-1的Mch，分別置于霧化吸入機中，測出不同濃度Mch誘導下的大鼠潮氣量和氣道流速，通過RL的變化得出氣道阻力的增加值（RL%）。

1.4支氣管肺泡灌 洗液白細胞計數：股動脈放血處死大鼠，用8 ml生理鹽水進行支氣管肺泡灌洗，灌洗分2次進行。回收支氣管肺泡灌洗液（BALF）。BALF 4℃，1000 r·min-1離心10 min，取上清液-80 ℃保存，沉淀用NS 0.5 mL混勻，取細胞混懸液100 μL用白細胞計數液100 μL稀釋，計數BALF中白細胞總數。

1.5病理學檢查 病理組織切片，常規HE染色觀察炎癥細胞浸潤，阿爾辛藍-過碘酸雪夫染色（AB-PAS）觀察氣道杯狀細胞及黏液分泌，測定如下指標。

1.5.1肺組織炎癥程度 HE染色切片中，根據炎癥及上皮脫落程度將炎癥分為\"+，++，+++三個等級。\"+\"為未見明顯炎癥細胞浸潤；\"++\"為少量炎癥細胞浸潤；\"+++\"為可見大量炎癥細胞浸潤，并可出現管壁破壞及（或）上皮脫落。

1.5.2杯狀細胞比值 每張AB-PAS染色切片中，計算1支支氣管和3～5支細支氣管陽性杯狀細胞數和柱狀上皮細胞的總數，得出陽性杯狀細胞數/柱狀上皮細胞總數的比值，即杯狀細胞陽性百分率，求平均值。

1.6肺組織MUC5AC含量測定 用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定。

1.7統計學方法 采用SPSS 16.0 for windows進行統計學分析，計量資料以x±s表示，采用兩組間均數t檢驗，等級資料采用RADIT分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組大鼠氣道阻力（RL） 在Mch 0.5，1.0，2.0，8.0，16.0 mg·mL-1濃度刺激下，模型組氣道阻力增加（RL%）較對照組有顯著性差異（P<0.05）。見圖1。

2.2 BALF中白細胞總數 模型組BALF中白細胞總數為（105.15±41.59）×107/L，對照組為（36.75±12.83）×107/L，可見模型組較對照組明顯增多（P<0.001）。

2.3兩組大鼠肺組織炎癥 光鏡下對照組肺組織無炎癥細胞浸潤，無肺泡擴張。模型組大鼠支氣管上皮明顯脫落，肺部炎癥細胞大量浸潤，有明顯支氣管炎及肺間質炎，見表1，圖2。

2.4 支氣管杯狀細胞增生及肺組織MUC5AC含量：模型組支氣管及細支氣管杯狀細胞較對照組明顯增生；杯狀細胞陽性%明顯增高；肺組織MUC5AC含量也明顯增高，見表2，圖3。

3討論

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以氣道炎癥和肺實質的破壞或肺氣腫為主要特征的慢性小氣道病變，其特征是持續存在的氣流受限，氣流受限常呈進行性加重，與肺部對有害顆粒或氣體的異常炎癥反應有關。其主要病因為吸煙和反復不斷的氣道感染。煙草中的有害物質會引起肺部炎癥和肺組織的破壞，并損害肺正常的防御和修復功能。肺組織的損害包括粘液高分泌、氣道狹窄、肺纖維化及肺氣腫等，這些病理學改變反過來又可導致氣流受限和其他病理學改變[2]。LPS是革蘭氏陰性菌的細胞壁成分，作為內毒素對機體產生致病作用。它可刺激單核巨噬細胞、中性粒細胞及上皮細胞等合成并釋放一系列前炎癥因子和炎癥因子，如：腫瘤壞死因子a（TNF-a）、白細胞介素8（IL-8）等，介導氣道和肺組織的炎癥反應[3]。本實驗我們采用熏煙和氣道內滴入脂多糖法建立COPD的大鼠模型，觀察其是否符合人類COPD病變。

氣道黏液高分泌是COPD的重要病理生理特征。在多種刺激因素如吸煙、LPS的作用下，杯狀細胞發生增生分化，并分泌黏蛋白MUC5AC。MUC5AC作為氣道黏液中的主要成分，對氣道黏液的彈性和黏附特性起重要作用，但黏液的過度分泌使氣道炎癥進一步發展，并損害患者的肺功能[4，5]。

本實驗顯示COPD模型組MUC5AC含量明顯增高，氣道上皮杯狀細胞增生，提示發生氣道重構。模型組氣道阻力增加，表明存在氣流阻塞，肺功能有所改變。模型組還出現了COPD典型的病理學改變，如炎癥細胞的浸潤。本模型符合人類COPD病變，可用于COPD進一步的實驗研究。

參考文獻：

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[2]姚婉貞，徐永健.慢性阻塞性肺疾病[M].北京， 北京大學醫學出版社， 2007：334.

[3]Soler N， Ewig S， Torres A， et al. Airway inflammation and bronchial microbial patterns in patients with stable chronic obstructive pulmonary disease[J].Eur Respir J，1999，l4（5）：101.

[4]Leikauf GD， Borchers MT， Prow S DR， et al. Mucin apoprotein expression in COPD[J].Chest，2002，121（5）：166S-182S.

[5]賴異，李雯.黏蛋白MUC5AC在慢性阻塞性肺疾病患者氣道中的表達及其臨床意義[J].華中科技大學學報（醫學版），2009，38（3）：385-388.

編輯/申磊