結核分枝桿菌MPB64抗原的制備與純化

摘要：根據GenBank結核分枝桿菌基因序列設計引物擴增出MPB64基因，連接至原核表達載體pET32a（+），轉化至大腸桿菌BL21（DE3），經過IPTG誘導后，進行SDS-PAGE和Western-blot分析。結果表明，克隆的MPB64基因同源率為98.36%，重組蛋白以可溶形式在細胞周質中表達，大小為24KDa。采用切膠回收水平電泳洗脫純化出的MPB64具有反應原性。為進一步研究結核快速診斷試劑奠定了基礎。

關鍵詞：牛分枝桿菌；MPB64；原核表達；切膠純化

結核病（Tuberculosis）是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis TB）引起的一種嚴重危害人民健康的慢性傳染病，世界衛生組織（World Health Organization，WHO）2012年的數據顯示，世界總共有880萬的結核病患者，相當于每10萬人中就有138個結核病患者，我國2010年結核病死亡人數54000，新發現結核患者869092，復發人數54216，新患者中出現MDR-TB人數為49000，再次感染的患者出現MDR-TB人數為14000，結核患者中得HIV的人數為145919，HIV患者中出現結核的人數為65412，相對于2006年后呈現逐漸增加的趨勢，每年用于結核的治療費用也從2006年開始遞增，2011年已經花費285百萬美元，預計2012年將花費350百萬美元。

結核菌素試驗作為最古老的免疫學試驗方法之一，仍然在使用，對于牛分枝桿菌的特異性抗原的篩選，仍然是診斷中的重點。MPB64抗原是牛分枝桿菌的分泌性抗原，表現為較強的遲發型超敏反應，并可誘導產生和釋放γ干擾素，且MPB64抗原對活動的牛結核的特異性為100%，敏感性為98.1%[1]，并且發現部分卡介苗菌株缺MPB64基因[2]，若此用其做皮試，可區分已患病、隱性感染未發病和己接種卡介苗的個體，故MPB64可能是最具有潛在應用價值的診斷試劑。

1資料與方法

1.1菌株與質粒 E.coli BL21（DE3）由本實驗室保存，表達載體pET32a（+），以及牛結核分枝桿菌DNA基因組由寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室提供。

1.2主要試劑 限制性核酸內切酶BamHI（15U/μL）、EcoR I（15U/μL）、ExTaq DNA聚合酶（5U/μL）、T4鏈接酶均購自大連TaKaRa公司；Marker DL2000、Protein Marker、瓊脂糖、氨芐霉素、IPTG均購自全式金公司；胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast extract）為OXOID產品；透析袋和PVDF膜均購自上海索萊寶公司； His-Tag鼠單抗購自Abmart公司；羊抗鼠IgG-HRP（酶標二抗）購自武漢博士德公司；膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒為杭州愛思進生物技術有限公司產品。

1.3引物的設計 根據GeneBank中已發表的Mycobacterium tuberculosis基因序列基因序列利用Primer 5.0軟件設計引物，序列如下：上游引物Mpb64-S：5'--TATGGATCCATGCTGGTCACGGCTGTCG --3'，（下劃線為BamH I限制性內切酶位點）；下游引物Mpb64-AS：5'--GCGGAATTCCTAGGCCAGCATCGAG

TC--3'（下劃線為RcoR I限制性內切酶位點），送由上海生工合成。

1.4 MPB64基因的克隆 取基因組模板1μL，上下游引物各1μL， dNTP 2μL， 10×PCR Buffer2.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL（15U/μL），加入12μLddH2O 補足20μLPCR反應體系，PCR條件為94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，擴增30個循環，72℃最后延伸50 min，1%瓊脂糖凝膠檢測。

1.5原核表達載體的構建 將膠回收的目的條帶和載體同時用BamH I和RcoR I分步雙酶切，才后按照摩爾比值5：1建立10μL連接體系，連接過夜后轉化大腸桿菌BL21（DE3），涂板AMP抗性LB平板，37℃培養過夜，挑取陽性菌落接種與5mlLB培養基住進行小搖，提質粒進行BamH I/RcoR I雙酶切鑒定，經鑒定正確的質粒近一步送測序公司測序。

1.6誘導表達 單個陽性菌落，用5mlLB培養基（含50μg/ml Amp）在37℃搖床培養至OD≈0.7～0.8，然后2%的比例接種至100ml的LB培養基含（50μg/ml Amp），37℃搖床250rpm培養至OD≈0.7～0.8， 此時加入2ml1mol/L IPTG；繼續37℃搖床200rpm誘導培養過夜，第2d清晨將培養基，12000 rpm 離心1 min，收集菌體，用PBS沖洗2次，加入10mlPBS沖懸菌體，置于液氮罐中反復凍融3次，此時菌液變透亮再次12000 rpm 離心10 min，獲取上清，加入等倍體積的2×SDS上樣緩沖液充分混勻后煮沸5min，進行SDS-PAGE電泳。

1.7蛋白純化 SDS-PAGE電泳結束后用預冷的0.25mol/LKCl浸泡膠至顯示出乳白色的蛋白條帶，切下目的條帶放入透析袋內，用夾子將透析袋的兩端夾緊，水平電泳裝置電泳5h，在電泳結束前，將透析袋換個方向電泳15min。電泳結束后，收集透析袋內的蛋白溶液，12000 rpm 離心5 min所獲上清即為所獲純化蛋白。

1.8 Western blot分析 表達產物和經過純化的目的蛋白進行SDS-PAGE電泳后，按照 3 mm濾紙、SDS-PAGE凝膠、PVDF膜、3 mm濾紙的順序制備三明治，放于Bio-Rad半干轉印儀中，以35 mA轉印25min；轉膜完成后依次進行進行一抗和二抗的孵育，最后在暗室中進行ECL發光，觀察結果。

2結果

2.1 MPB64基因的克隆 以基因組模板進行PCR，擴增得到了大小約687bp左右的目的條帶（圖1），與預期大小一致。構建重組質粒pET32a+-mpb64后測序結果表明，所克隆MPB64基因序列與GenBack發表的基因序列同源性為98.36%。

3討論

結核分枝桿菌作為人獸共患結核病的病原微生物，長久以來一直威脅著養殖業的發展和人類的健康，鑒于早期診斷的重要性，篩選特異性抗原就顯得尤為重要。結核分枝桿菌能夠分泌多種保護性抗原成分，如CFP-10，ESAT-6、Aga85b、MPB70、MPB64等等，研究發現MPT64基因僅存在于 Tb 的 H37Rv，H37Ra，Erdman及BCG 的一些亞株如Tokyo，Moreau，Russian 株之中，而 BCG 的其他亞株 Glaxo，Pasteur，Canadian，Tice，Danish 1331 和麻風分枝桿菌則缺乏該基因[3]，并且MPB64作為早期結核分枝桿菌的特異性分泌蛋白，能夠早期刺激機體產生較高水平的細胞和體液免疫應答，是開發疫苗和早期診斷的理想候選抗原[4-6]。

本實驗成功從結核分枝桿菌基因組中擴增出MPB64基因，并且成功構建原核表達載體pET32a+-mpb64，并成功在大腸桿菌中得到誘導表達。結果顯示MPB64蛋白為可溶性表達，位于細胞質中，大小為24KDa。由于pET32a（+）載體系統帶有His-Tag標簽，經過Western-blot分析進一步顯示，24KDa的蛋白條帶有His-Tag標簽，證明了重組蛋白的正確性。本實驗采用了切膠水平洗脫的方法進行簡易制備，結果顯示切膠法能夠獲得比較純的蛋白，并且純化的蛋白能夠與標準牛陽性血清發生特異性反應。

最新的報告顯示，全球每過一秒鐘就會產生一名新的結核病的感染者，如果不加以控制，未來10年內估計將會有有3億人受感染。世界衛生組織發布了《2011～2015年遏制結核病全球計劃：為消除結核病努力奮斗》的全球行動計劃，這個計劃首次針對全球結核病治療與研究工作，明確了其中存在的一些缺陷，其主旨是在今后5年內遏制結核病在全球的蔓延，力爭實現減少結核病死亡人數，進而根除結核病的目標。本實驗為進一步建立結核病新型快速診斷試劑奠定了基礎。

參考文獻：

[1]Fifis T， Plackett P， Corner L， et al. Purification of a major Mycobacterium bovis antigen for the diagnosis of bovine tuberculosis[J]. Scandinavian journal of immunology，1989：（1），91-101

[2]Philipp W J， Schwartz D C， Telenti A， et al. Mycobacterial genome structure （minireview）[J]. Electrophoresis，1998：（4），573-576

[3]孫平，駱旭東，朱道銀，等.MPT64 DNA疫苗對鼠結核分枝桿菌感染的保護作用[J].第四軍醫大學學報，2004：（19）：1741-1744.

[4]宮強，曲寧，劉思國.牛結核桿菌MPB64蛋白的真核表達[J].華北農學報，2009：（005）：214-216.

[5]Oettinger T， Holm A， Mtoni I M. et al. Mapping of the delayed-type hypersensitivity-inducing epitope of secreted protein MPT64 from Mycobacterium tuberculosis[J]. Infection and immunity，1995： （12）：4613.

[6]Roche P， Winter N， Triccas J. et al. Expression of Mycobacterium tuberculosis MPT64 in recombinant Myco. smegmatis： purification， immunogenicity and application to skin tests for tuberculosis[J]. Clinical Experimental Immunology， 1996：（2）：226-232.編輯/申磊